[发明专利]一种利用CUTTag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种利用CUTTag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂盒及方法，该试剂盒包括：生物素化的Tn5转座酶、细胞核提取液、抗体杂交液、链霉亲和素洗涤液、DNA洗脱液、一抗、二抗、DNA纯化磁珠、链霉亲和素磁珠、蛋白酶抑制剂、毛地黄皂苷溶液、Triton X‑100溶液、预装的Phase Lock Gel凝胶、DNA共沉淀剂和PCR反应液等试剂。本发明克服现有CUTTag技术在植物中应用的缺陷和不足，提供一种在动植物、特别是丰度较低的染色质结合蛋白与DNA的互作研究中广泛适用的CUTTag‑seq和CUTTag‑qPCR策略及相应试剂盒，促进表观遗传调控新技术新手段的发展。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用CUTTag技术鉴定植物中转录因 子与染色质互作的试剂盒及方法。

背景技术

基因表达调控在多细胞生物的生长和发育中起关键作用。在多细胞生物中，所有细胞都具有相同的基因组序列。但是，基因组调控，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、 转录因子及其募集的蛋白质复合物的差异结合，导致不同组织和不同发育时期的基因 表达差异。

染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是一种广泛使用的染色质 分析方法，是用于全基因组DNA-蛋白质相互作用的研究的金标准。ChIP实验的原理是将目的蛋白和DNA的结合用甲醛固定，然后将染色质复合通过机械超声或者酶切 的方式片段化，随后进行基于抗体与靶标蛋白的免疫共沉淀富集作用，从而将与靶标 蛋白互作的染色质片段同时富集下来，进一步地，富集的染色质片段可以用于后续的 高通量测序研究全基因范围内的结合表征，或者用于荧光定量PCR(qPCR)实验验证转 录因子与特殊DNA候选位点的结合状况。

2019年，西雅图佛瑞德哈金森癌症研究中心开发的CUTTag(Cleavage UnderTargets and Tagmentation,CUTTag)技术是一种研究表观基因组染色质分析策略的新技术。其原理与ChIP存在本质的差异。从原理上看，CUTTag是一项酶栓系 (enzyme-tethering)策略，它首先利用抗体在完整的细胞或者细胞核内识别靶标蛋白， 随后加入Protein A/G融合的Tn5转座酶识别与靶标蛋白结合的抗体，因此，Tn5转座 酶被栓系在靶标蛋白及其结合的染色质附近，在镁离子的作用下，Tn5转座酶对临近 的染色质进行切割并加入DNA接头，产生的靶标片段用于后续建库和高通量测序。

CUTTag的功能与常规ChIP技术相同，却有其独特的优势：1)由于原位激活转 座酶而产生的高分辨率和低背景信号；2)因为不需要DNA超声处理片段化染色质， 建库过程不需要加接头，大大简化了实验操作和建库流程，节省了实验时间；3)由于 该过程的高灵敏度，因此只需少量起始原料。

CUTTag技术是一个全新的技术，仍然在迅速的发展完善过程中。CUTTag技 术最初开发出来的时候被用于动物细胞染色质状态分析。目前CUTTag在组蛋白修 饰研究中的流程/方法已经在动物细胞和植物中都有具体的报道，甚至在动物中，利用 CUTTag进行组蛋白修饰的研究已经发展到了单细胞的水平。然而，由于植物具有 细胞壁组织及多种次生代谢产物的影响，针对特殊植物转录因子与染色质结合研究的 CUTTag流程仍然是个挑战。