[发明专利]β-甘露聚糖酶突变体及应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及耐酸耐热的β‑甘露聚糖酶突变体及基因和突变体的制备方法。本发明对来源于黑曲霉的β‑甘露聚糖酶ManA氨基酸序列中第129、258、345和424位点的氨基酸V、W、G和K分别突变为I、R、A和R，获得耐酸、耐热的β‑甘露聚糖酶突变体及其突变基因，同时将含有突变基因的重组表达载体，转入酵母菌株中，通过甲醇诱导表达，最高酶活水平达到51000U/mL，能进一步降低β‑甘露聚糖酶的生产成本，促进β‑甘露聚糖酶在饲料食品行业的广泛应用，且能积极应对因新冠疫情带来的原材料价格上涨的困局。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及耐酸耐热的β-甘露聚糖酶突变体及编码基因和突变体的制备方法。

背景技术：

甘露聚糖是植物半纤维素的主要成分，广泛存在于自然界中，它是多种植物细胞壁的主要组成成分，作为植物性饲料原料被视为一种抗营养因子。β-甘露聚糖酶在饲料工业中作为一种饲料添加剂，能有效地降解饲料中的甘露聚糖，提高动物对饲料的消化能力。

目前，β-甘露聚糖酶是我国己经批准使用的12种饲料级酶制剂中的一种，并且作为一种高效的饲料添加剂广泛应用于饲料工业中。从上个世纪90年代以来，欧美国家90％的家禽饲料中添加酶制剂，60％的猪用口粮中添加酶制剂。我国起步较晚，但其一直是饲料生产和应用研究的重点，β-甘露聚糖酶作为一种重要的饲料用酶，近年来受到了越来越多的重视。

自然界β-甘露聚糖酶主要来源于微生物，包括曲霉属、青霉属、木霉属等丝状真菌以及芽孢杆菌属和放线菌属等细菌。真菌β-甘露聚糖酶作用pH值范围一般为酸性至中性，细菌甘露聚糖酶多为中性至碱性。

目前饲料添加剂用酶都需要经过高温制粒，制备能够耐高温、耐酸、具有对消化酶耐受性提高的β-甘露聚糖酶，对于β-甘露聚糖酶在饲用酶和工业化应用具有重要价值。

野生型的β-甘露聚糖酶基因经过异源表达和理性设计后能够获得较好的酶学性质，对于提高现有的β-甘露聚糖酶的耐高温性能发挥着至关重要的作用。毕赤酵母表达系统已经发展成为一个成熟的外源蛋白表达系统，工业上常用来大规模表达外源蛋白。

发明内容：

本发明的主要目的是提供一种β-甘露聚糖酶突变体及其基因、及含有该基因的重组表达载体和重组菌株、及该重组菌制备β-甘露聚糖酶的方法，旨在解决现有技术中β-甘露聚糖酶耐酸、耐高温性差的问题。

为实现上述目的，本发明通过将来源于黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCCNo.10788的甘露聚糖酶ManA氨基酸序列中第129、258、345和424位点的氨基酸V、W、G和K分别突变为I、R、A和R，获得耐酸、耐热的β-甘露聚糖酶突变体，所述突变体具有序列表SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。

本发明还提供上述突变体的编码基因；

进一步地，所述编码基因具有序列表SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列。

本申请还提供一种重组表达载体，包含上述的β-甘露聚糖酶突变编码基因；

优选地，所述重组表达载体的表达载体为pPIC9。

本申请还提供一种重组菌株，包含上述的β-甘露聚糖酶突变编码基因或重组表达载体；

优选的，所述菌株的宿主细胞为毕赤酵母；

本申请还提供上述重组表达载体或重组菌株的应用，特别是在制备β-甘露聚糖酶中的应用；

进一步地，采用上述重组菌株制备β-甘露聚糖酶的方法如下：