[发明专利]一种血小板裂解液及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种血小板裂解液及其制备方法和应用，属于细胞生物学技术领域，所述血小板裂解液的制备方法，包括以下步骤：1)将多份来源不同的健康人的抗凝全血混合、去除红细胞后，收集富血小板血浆；2)将步骤1)中获得的富血小板血浆超声处理后，离心，收集第一上清液；3)将所述第一上清液与氯化钙混合、静置后，收集第二上清液即为血小板裂解液。本发明所述制备方法能够明显提高血小板裂解液中细胞因子的含量，制备获得的血小板裂解液可完全替代胎牛血清培养细胞。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种血小板裂解液及其制备方法和应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一种异质性的基质干细胞亚群，可以从许多成体组织中分离出来。它们可以分化成中胚层细胞系，如脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞，以及其他胚胎细胞系的细胞。骨髓间充质干细胞可以与先天性和适应性免疫系统的细胞相互作用，从而调节多种效应器功能。间充质干细胞在人体组织中比例较低，若要达到临床治疗所需细胞数量，必须进行体外大规模扩增。目前间充质干细胞的扩增体系主要是含胎牛血清的培养基。由于胎牛血清属异种蛋白，含有动物携带的细菌、病毒、蛋白传染性疾病等潜在危险。寻找人源性成分的培养基成为亟待解决的问题。

血小板含有三种主要的颗粒：α颗粒、致密颗粒和溶酶颗粒，具有黏附、聚集及释放等多种生物功能。α颗粒是血小板内最大和最多的分泌型颗粒，含有血管和组织形成过程中的重要生长因子。血小板在活化时会释放各种血小板源性细胞因子，包括血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF–β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)，这些生长因子可以刺激成纤维细胞、平滑肌细胞和造骨细胞的增殖，并能吸引多种细胞成分参与损伤组织的修复，并可以诱导MSCs及内皮细胞进行有丝分裂、分化及复制，可促进组织愈合。

人血小板裂解液(human platelet lysate,HPL)可来自自体或同种异体全血，富含多种促进间充质干细胞增殖分化的细胞因子和免疫相关因子。已有一些专利公开了血小板裂解液的制备方法，如中国专利CN 104673747A：一种血小板裂解液的制备方法及其应用；以及中国专利CN107384856A：一种制备血小板裂解液的方法。但是，已开发的血小板裂解液都存在一些不足，如制备血小板裂解的血小板来源复杂且不易于获得，以及血小板裂解液中的纤维蛋白没有去除等。这些问题很大程度上限制了血小板裂解液在细胞体外培养中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备方法简单、培养细胞效果好的血小板裂解液及其制备方法和应用。进一步的，本发明提供的是富血小板血浆(platelet-richplasma,PRP)的衍生物，是将富血小板血浆中浓缩的血小板进一步裂解后所获得的液体成分；本发明所述制备方法能够明显提高血小板裂解液中细胞因子的含量，制备获得的血小板裂解液可完全替代胎牛血清培养细胞。

本发明提供了一种血小板裂解液的制备方法，包括以下步骤：

1)将多份来源不同的健康人的抗凝全血混合、去除红细胞后，收集富血小板血浆；

2)将步骤1)中获得的富血小板血浆超声处理后，离心，收集第一上清液；

3)将所述第一上清液与氯化钙混合、静置后，收集第二上清液即为血小板裂解液。

优选的，步骤1)中所述抗凝全血为5～200份。

优选的，步骤1)中所述抗凝全血为40～100份。

优选的，步骤2)中所述超声处理为间歇性超声处理：超声处理4～6s，停止4～6s，循环8～12次；所述超声处理的功率为150～250W。

优选的，步骤2)中所述的离心的转速为4000～6000rpm，所述离心的时间为25～35min。