[发明专利]基于计算机模拟筛选牡丹籽粕单体化合物中的FASN抑制剂实验方法

权利要求书

1.基于计算机模拟筛选牡丹籽粕单体化合物中的FASN抑制剂实验方法，其特征在于：该计算机模拟筛选牡丹籽粕单体化合物中的FASN抑制剂实验方法具体操作步骤如下：

S1、分子对接；

S2、细胞活力检测-MTT法；

S3、蛋白质免疫印迹；

S4、细胞凋亡检测；

S1步骤中分子对接具体操作步骤如下：

在Linux系统环境下安装AutoDock、Openbabel软件；

1)准备受体pdb文件，使用PyMOL软件检查受体结构，去除可能包含的结晶水和小分子配体等结构；

2)AutoDock Tool将配体和受体文件批量转换为pdbqt文件；

3)将受体pdbqt文件分别放入顺序排列的文件夹中；

4)设置脚本内的配体和受体名称、盒子大小及坐标等相关参数即可进行AutoDock对接；

5)提取分子对接生成的log文件。

2.根据权利要求1的基于计算机模拟筛选牡丹籽粕单体化合物中的FASN抑制剂实验方法，其特征在于：S2中的细胞活力检测-MTT法具体操作步骤如下：

1)待96孔板中细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清DMEM处理细胞24h，每个药物浓度重复6孔；

2)提前将MTT和DMSO配制5mg/mL的MTT溶液；

3)按照9:1的比例将无血清培养液和MTT溶液(5mg/mL)配制成0.5mg/mL混合液；

4)弃培养液，每孔加入PBS清洗，每孔加入100μL混合液；

5)37℃恒温培养1h；

6)弃混合液，每孔加入并吹打100μL DMSO；

7)使用酶标仪测492nm处吸光值。

3.根据权利要求1的基于计算机模拟筛选牡丹籽粕单体化合物中的FASN抑制剂实验方法，其特征在于：S3中的蛋白质免疫印迹具体操作步骤如下：

1)将细胞接至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h，每个药物浓度重复3孔；

2)PBS洗涤细胞，加入120μL裂解液，刮取至离心管；

3)冰上超声4min；

4)4℃离心，上清液移至新离心管中。

5)BCA法测定蛋白浓度并调平；

6)按比例加入4×Loading Buffer，95℃煮样10min，样品可放置于-20℃保存；

电泳

1)配制SDS-PAGE分离胶：随后按照凝胶配方配制ddH₂O、30％AB、1.5M Tris-HCL(pH8.8)、10％AP、TEMED并涡旋混匀，每个制胶板加入7mL分离胶，加水补齐，等待凝固；

2)配制SDS-PAGE浓缩胶：随后按照凝胶配方配制ddH2O、30％AB、1M Tris-HCL(pH6.8)、10％AP、TEMED并涡旋混匀，倒掉制胶板中的水，加浓缩胶补齐，并插梳子，等待凝固；

3)配制1×Running Buffer：将5×Running Buffer和超纯水按1:4比例稀释并颠倒混匀；

4)将制胶板置于电泳槽，加1×Running Buffer，拔梳子，每孔加适量Marker或样品；

5)电泳：恒压80V电泳30min，再调至120V电泳使条带跑至凝胶底部；

转膜

1)配制1×Transfer Buffer：5×Transfer Buffer、无水甲醇和超纯水按1:1:3比例稀释并颠倒混匀；

2)剪膜：PVDF在甲醇中浸泡激活；

3)转膜：海绵和三层滤纸放置在转膜夹上，经Transfer Buffer浸泡，将凝胶放置在转膜夹的黑色部分并将膜覆于其上，夹上转膜夹，插入槽中，恒流250mA转膜2.5h左右使样品从凝胶充分转移至膜上；

孵育抗体

1)洗膜：提前稀释10×TBS溶液至1×TBST溶液，待转膜完毕后，用1×TBST溶液摇床清洗3次，每次10min；

2)封闭：按每20mL TBST加入1g脱脂奶粉的比例提前配制封闭液，并将膜放入封闭液，37℃摇床1h；

3)孵育一抗：用一抗稀释液稀释一抗，将膜置于一抗孵育液；4℃孵育过夜；

4)洗膜：TBST洗膜3次；

5)孵育二抗：膜放入含二抗的封闭液中，37℃摇床1h；

6)洗膜：TBST洗膜3次；

显影

1)配制ECL发光液：两种溶液按1:1比例混合；

2)使用曝光机显影，选择ImageLab软件的印迹Chemi选项，曝光前均匀滴加160μL发光液，得到条带后使用ImageJ软件定量分析条带的灰度值并使用GraphPad Prism软件作图，每个实验重复三次。