[发明专利]构建稳定遗传的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株的方法及其应用

权利要求书

1.构建稳定遗传的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株的方法，其特征在于：

包括以下步骤：首先，在宿主内整合编码酪氨酸分解酶(TAL)、香豆酸辅酶A连接酶(4CL2)以及β-肉桂酰羟基化酶(phdE)、β-肉桂酰氧化酶(phdB)、β-肉桂酰脱酰酶(phdC)的基因,构建熊果苷生产过程中的关键中间体对羟基苯甲酸的高产菌株；然后在该宿主内整合编码4-羟基苯甲酸羟化酶(4HB1H)和葡萄糖基转移酶(TGS)的基因，构建了能够稳定遗传生产β-熊果苷的基因工程菌株；最后，宿主内整合编码3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶(aroG)、3-磷酸莽草酸酯-1-羧基乙烯基转移酶(AroA)、莽草酸激酶(AroL)、分支酸合成酶(AroC)的基因以及敲除trpE和pheA基因，获得了稳定遗传的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将基因TAL、4Cl2、phdE、phdB、phdC插入到基因pgi之后，基因4HB1H、TGS替换基因组上的假意义基因yneO，基因aroG、aroA、aroL、aroC插入到基因ack的后面。

3.应用权利要求1所述方法所制备的基因工程菌的应用，其特征在于：将所构建的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株涂于无抗生素的平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆到液体LB中培养10h，接种到发酵培养基中，37℃进行发酵从头合成生产熊果苷。

4.根据权利要求3所述的高产β-熊果苷的基因工程菌的应用，其特征在于：所述发酵培养基包括20g/L葡萄糖、20g/L甘油，3g/L酵母粉，1g/L MOPS,5g/L NaHPO₄，1g/L NaCl，3g/LKH₂PO₄，1g/L NH₄Cl，250mg/L MgSO₄，15mg/L CaCl₂，溶剂为水。