[发明专利]构建稳定遗传的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株的方法及其应用

说明书

本发明提供了构建稳定遗传的β‑熊果苷高效生物合成的基因工程菌株的方法及其应用。首先，在宿主内整合编码酪氨酸分解酶、香豆酸辅酶A连接酶、β‑肉桂酰羟基化酶、β‑肉桂酰氧化酶、β‑肉桂酰脱酰酶(phdC)的基因，构建能够高产对羟基苯甲酸的宿主菌株。其次，在该宿主内整合编码4‑羟基苯甲酸羟化酶和葡萄糖基转移酶的基因，构建能够生产β‑熊果苷的菌株。最后将编码核心途径的基因莽草酸途径基因整合到上述工程菌的基因组上，同时敲除竞争途径基因构建了稳定遗传的β‑熊果苷高效生物合成的基因工程菌株，摆脱了应用质粒对工程菌生产造成不稳定的影响，对β‑熊果苷的工业化生产极具有应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及到β-熊果苷高产菌株的构建及其方法和应用。

背景技术

β-熊果苷又称对苯二酚葡萄糖苷、4-羟基苯基-β-D-吡喃葡糖苷，存在于熊果树、越橘树、梨树、冬青树等的植物叶子中，具有抑制酪氨酸酶阻止黑色素形成的能力，具有美白护肤的功效，广泛的应用在医疗和化妆品行业中。获取熊果苷的方法主要有四种：植物提取法、化学合成法、酶转化法、生物合成法，植物提取法的生产过程复杂，同时受环境季节的影响，使其产量较低；由于低催化效率和低选择性，化学合成熊果苷的方法也不是首选；由于氢醌的毒性，抑制酶的活性，并且底物和产物的分离困难，造成能源上的浪费；生物合成法可以葡萄糖为碳源，构建质粒将途径基因转化到宿主菌中从头合成熊果苷，但是质粒的不稳定性遗传影响生产菌株的活性，使工程化的大肠杆菌维持系数降低。

本发明将部分途径基因整合到宿主菌的基因组无需表达质粒就可以生产β-熊果苷，提高工程菌株生产功能的稳定性，节约生产成本，同时过表达莽草酸途径和敲除竞争途径基因，提高生产熊果苷途径的碳通量，进而使熊果苷的产量提高原来的1.5倍，生产熊果苷的产量为9.3±0.03g/L。

发明内容

1.本发明的一个目的是提供高产β-熊果苷的基因工程菌。

2.上述基因工程菌，所述的目的菌为大肠杆菌。

3.本发明构建的基因工程菌，通过过表达莽草酸途径、敲除竞争途径基因以及整合生产对羟基苯甲酸的途径基因，构建了一种高产对羟基苯甲酸的基因工程菌株，然后，在该工程菌中整合编码4-羟基苯甲酸羟化酶(4HB1H)和葡萄糖基转移酶(TGS)的基因，进而构建了一株高产β-熊果苷的菌株。实验结果表明，该工程菌株利用葡萄糖、甘油等简单碳源来生产β-熊果苷能达到9.3±0.03g/L的最终产量。

4.上述高产β-熊果苷的基因工程菌：在宿主内整合编码酪氨酸分解酶(TAL)、香豆酸辅酶A连接酶(4CL2)、β-肉桂酰羟基化酶(phdE)、β-肉桂酰氧化酶(phdB)、β-肉桂酰脱酰酶(phdC)的基因，然后在宿主内整合编码4-羟基苯甲酸羟化酶(4HB1H)和葡萄糖基转移酶(TGS)的基因，最后在宿主内整合编码3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶(AroG)、3-磷酸莽草酸酯-1-羧基乙烯基转移酶(AroA)、莽草酸激酶(AroL)、分支酸合成酶(AroC)的基因。

5.本发明还提供了一种上述高产β-熊果苷的工程菌的构建方法，包括步骤：

构建基因工程菌株：应用crispr cas9技术在宿主内整合编码酪氨酸分解酶(TAL)、香豆酸辅酶A连接酶(4CL2)、β-肉桂酰羟基化酶(phdE)、β-肉桂酰氧化酶(phdB)、β-肉桂酰脱酰酶(phdC)的基因构建能够生产对羟基苯甲酸的菌株，然后在宿主内整合编码4-羟基苯甲酸羟化酶(4HB1H)和葡萄糖基转移酶(TGS)的基因构建能够生产β-熊果苷的工程菌的菌株，最后在宿主内整合3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶(AroG)、3-磷酸莽草酸酯-1-羧基乙烯基转移酶(AroA)、莽草酸激酶(AroL)、分支酸合成酶(AroC)的基因，同时敲除竞争途径基因trpE和pheA基因，构建一株稳定高产β-熊果苷的工程菌。