[发明专利]一种粪肠球菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用

说明书

本发明属于质粒载体构建领域，提供一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用。该穿梭质粒载体是由粪肠球菌质粒pLW4与载体pMD20连接构建而成。本发明提供的穿梭质粒载体可在大肠杆菌和粪肠球菌中复制。粪肠球菌中遗传操作体系尚不成熟、转化步骤较繁琐，而大肠杆菌中基因克隆操作十分便利。利用该穿梭质粒载体在大肠杆菌中完成外源基因克隆和重组质粒构建，可以为乳酸菌基因操作提供新工具，便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。

技术领域

本发明属于质粒载体构建技术领域，更具体地，涉及一种粪肠球菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用。

背景技术

粪肠球菌是人和动物肠道中的正常菌群，也是一种重要的乳酸菌，具有较好的肠道粘附能力，能产生乳酸及一些抗菌物质，抑制肠道腐败菌、致病菌的繁殖及肠道感染，降低腹泻率，促进营养物质的消化吸收，增强免疫力，提高采食量及饲料转化率，促进动物健康，是畜牧生产及食品工业首选使用的益生菌菌种之一。粪肠球菌表现多种优良性状，其中一个主要原因是含有多种质粒，本实验室从粪肠球菌中分离得到一种质粒，命名为质粒pLW4，该质粒具有多种位点和抗性，具有良好的载体特征。

pMD20是一种高效克隆PCR产物的专用载体。该载体以pUC19载体为基础，在其多克隆位点处的Xba I和BamH I位点之间增加了Spe I、Nde I、EcoR V三种酶切位点，经EcoR V酶切后再在两侧的3’端添加“T”制备而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’端添加一个“A”的特性，所以可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

虽然质粒pLW4和pMD20均可单独作为载体来使用，但是如果可以将其优点相结合，就可以发挥它们各自的优势，本发明结合质粒pLW4和pMD20两方面的优点，利用现代技术构建了一种全新的穿梭质粒载体pLWPU01，可以为乳酸菌基因操作提供新工具，便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的质粒载体，为乳酸菌基因操作提供新工具，便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。

具体地，本发明的第一方面提供一种穿梭质粒载体，该穿梭质粒载体由粪肠球菌质粒pLW4与载体pMD20连接构建而成；所述粪肠球菌质粒pLWPU01为双链环状 DNA 分子，共7415bp，含有6个开放阅读框，GC含量为33.12%。

具体地，所述粪肠球菌质粒pLW4的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示（质粒图谱如图3所示）。

最具体地，所述穿梭质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示（质粒图谱如图2所示）。

本发明的第二方面提供一种穿梭质粒载体的构建方法，包括以下步骤：

（1）以粪肠球菌质粒pLW4为模板，通过引物P1和P2进行PCR，得到线性化pLW4质粒，纯化后回收该线性化pLW4质粒；

P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3（5’-ATCAGCGCTATACCGTTCACGG-3’）所示，P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4（5’-CTGCTCTAGGTAGCGGACAGAT-3’）所示；

（2）用T4连接酶将纯化回收后的线性化pLW4质粒和载体pMD20进行连接；

（3）将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞（例如E.coli DH5α感受态细胞），挑取转化子，提取得到所述穿梭质粒载体。

本发明的第三方面提供上述穿梭质粒载体的应用。

具体地，本发明提供所述穿梭质粒载体在筛选粪肠球菌标记抗性基因构中的应用。