[发明专利]一种利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法及应用

权利要求书

1.一种利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计基于NtDFR1和NtDFR2基因的sgRNA序列：

DFR1-sgRNA：GTCATGAGACTCCTTGAACGTGG；

DFR2-sgRNA：GAAGCCATTCAAGGCTGTCAAGG；

(2)设计并合成sgRNA PCR引物：

DFR1-sgRNA上游引物：AGGGTCATGCCATACAAAGAGAC；下游引物：AGCTGTTCATGCCCCTTCTC；

DFR2-sgRNA上游引物：ACATTCCCCTGACTGTTGGTTT；下游引物：GCGGACTTGTCAGTGGAAGG；

(3)sgRNA表达载体的构建：

将靶序列上下游引物双链退火并与预先用BsaI酶切过的pORE-Cas9骨架载体连接，得CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体；

(4)将CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体转化农杆菌中：

取连接产物转化Trans5α感受态细胞，37℃培养12～16h；

(5)侵染愈伤组织及阳性筛选：

利用悬浮农杆菌菌液浸泡侵染烟草叶盘10min后，再将叶盘置于含2.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA的MS固体培养基上培养；

用U26-JCF：5'-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3'和靶序列下游引物对菌斑进行阳性克隆的PCR扩增、克隆和测序筛选；从测序正确的菌中提取纯化质粒，-20℃冰箱保存备用；

(6)以液相色谱进行NtDFR1和NtDFR2基因纯合敲除素材的现蕾期叶片的烟碱含量的检测试验。

2.根据权利要求1所述的利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法，其特征在于，步骤(3)的连接体系为：酶切载体100ng，退火产物2μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer 1μL，ddH2O补齐至10μL，16℃连接30min。

3.根据权利要求1所述的利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法，其特征在于，步骤(3)中，CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体为pORE-Cas9。

4.根据权利要求1所述的利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法，其特征在于，步骤(4)具体为：

将携带CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体的农杆菌LBA4404菌液浸泡侵染烟草叶盘，并获得T0代编辑植株种子和T1代种子。

5.根据权利要求1所述的利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法，其特征在于，步骤(4)中的液相色谱条件为：

色谱柱：CAPCELL PAK CR柱；

流速：0.8mL/min；

柱温：30℃；

进样量：10.0μL；

流动相A：乙酸：甲醇：水＝2％：10％：88％；流动相B：乙酸：甲醇：水＝2％：88％：10％；

检测时间：42.5min；

检测波长：340nm。

6.根据权利要求1所述的利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法，其特征在于，所述烟草的品种为红花大金元。

7.一种烟草突变体，其特征在于，所述烟草突变体是通过权利要求1-6任一所述的利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法获得的植株。

8.一种根据权利要求1-6任一所述的利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法在选育烟草新品种中的应用。