[发明专利]一种利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法及应用

说明书

本发明公开了一种利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇‑4‑还原酶基因提升芸香苷含量的方法及应用。该方法包括以下步骤：(1)设计基于NtDFR1和NtDFR2基因的sgRNA序列；(2)设计并合成sgRNA PCR引物；(3)sgRNA表达载体的构建；(4)将CRISPR/Cas9‑sgRNA表达载体转化农杆菌中；(5)侵染愈伤组织及阳性筛选；(6)以液相色谱进行NtDFR1和NtDFR2基因纯合敲除素材的现蕾期叶片的烟碱含量的检测试验。本申请的方法为烟草的香味、吃味以及颜色等品质调控的品种培育研究提供遗传材料和理论依据。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法及应用。

背景技术

赋予水果和蔬菜红、蓝、紫等颜色的花青素属于广泛存在的统称为类黄酮的酚类化合物。类黄酮(Flavonoid)是植物中一类重要的次生代谢物质，广泛存在于水果、蔬菜、谷物、豆类、茶叶、烟草、药用植物和观赏植物等多种植物中。类黄酮参与植物的生长发育、植物花果实和种子的显色反应以及植物的抗逆反应。类黄酮的生物合成途径非常庞大，目前己经发现有至少九条分支代谢途径，即查尔酮途径、橙酮途径、黄酮途径、黄酮醇途径、黄烷醇途径、异黄酮途径、类黄酮醇途径、原花青素途径、花青苷途径。研究发现，参与花青苷合成的酶主要有查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、查尔酮异构酶(chalconeisomerase,CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(flavonol 3-hydroxylase,F3H)、二氢黄酮醇还原酶(Dihydroflavonol-4-reductase,DFR)、花青素合成酶(ANS)和类黄酮-3-葡糖基转移酶(3GT)等。二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)以NADPH为辅酶立体专一性地将黄烷酮醇还原为无色花色素(flavan-3,4-diol,黄烷-3,4-二醇)。DFR是花青素生物合成途径中最重要的酶之一，它启动花青素生物合成的第一步，在花色的修饰中起重要作用。DFR催化三种无色黄烷酮醇，二氢山萘酚(dihydrokaempferol,DHK)、二氢槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)和二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)还原成无色花色素。这些无色花色素之后被转换成天竺素，花青素和飞燕草素。从烟草花中分离到两种二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)cDNA，NtDFR1和NtDFR2，序列比对分析发现，这两个基因与多个分离自其它种属植物的DFR基因具有高度的序列相似性，分别起源于拟茸毛烟草和毛叶烟。

类黄酮根据结构上的差异可以分成黄酮醇(flavonols)、黄酮类(flavones)、黄烷醇(flavanols)、花青素(anthocyanins)和原花青素(proanthocyanidins,PAs)等。其中，芸香苷是一种广泛存在于植物体内的黄酮醇配糖体，其生物合成来源于类黄酮代谢路径。植物黄酮醇的合成是以4-香豆酸CoA和丙二酰辅酶A为底物进行的，依次经过查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)的催化形成柚皮素(naringenin)。接着，黄烷酮-3-羟化酶(F3H)和类黄酮-3’-羟化酶(flavonol 3’-hydroxylase,F3’H)可以依次催化柚皮素杂环和B环3号位的羟基化，分别生成二氢山奈素(DHK)和二氢槲皮素(DHQ)。随后黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)可以催化二氢山奈素和二氢槲皮素下分别生成山奈酚(kaempferol)和槲皮素(quercetin)，再经过糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)等的催化反应生成芸香苷等黄酮醇类物质。