[发明专利]RIPLET敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用在审
| 申请号： | 202111392731.1 | 申请日： | 2021-11-19 |
| 公开（公告）号： | CN114058619A | 公开（公告）日： | 2022-02-18 |
| 发明（设计）人： | 郑海学;朱紫祥;张向乐;曹伟军;杨帆;唐闻达;李攀;齐晓兰;顾峰幸;陈文哲;张克山;刘湘涛 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/55;C12N5/10;A61K39/125;A61K39/135;A61P31/14 |
| 代理公司： | 北京力量专利代理事务所(特殊普通合伙) 11504 | 代理人： | 毛婷 |
| 地址： | 730046 *** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | riplet 细胞系 构建 作为 核糖核酸 病毒科 病毒 疫苗 生产 应用 | ||
1.抑制或者沉默细胞中RIPLET基因的表达的试剂在制备小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括靶向敲除RIPLET基因的sgRNA，和/或Cas9蛋白的mRNA序列。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述sgRNA包括RIPLET-sgRNA和RIPLET-sgRNA2中的至少一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：
RIPLET-sgRNA1-F：5’-CACCGTGAGCTGCATTATCTGCCAA-3’；
RIPLET-sgRNA1-R：5’-AAACTTGGCAGATAATGCAGCTCAC-3’；
RIPLET-sgRNA2-F：5’-CACCGCCTACTGTTGCAGGACCTGG-3’；
RIPLET-sgRNA2-R：5’-AAACCCAGGTCCTGCAACAGTAGGC-3’。
4.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述小核糖核酸病毒科病毒包括口蹄疫病毒和塞内卡病毒。
5.一种特异性靶向RIPLET基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括RIPLET-sgRNA和RIPLET-sgRNA2中的至少一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：
RIPLET-sgRNA1-F：5’-CACCGTGAGCTGCATTATCTGCCAA-3’；
RIPLET-sgRNA1-R：5’-AAACTTGGCAGATAATGCAGCTCAC-3’；
RIPLET-sgRNA2-F：5’-CACCGCCTACTGTTGCAGGACCTGG-3’；
RIPLET-sgRNA2-R：5’-AAACCCAGGTCCTGCAACAGTAGGC-3’。
6.如权利要求5所述的sgRNA在制备RIPLET基因敲除细胞系中的应用。
7.一种RIPLET基因编码蛋白功能丧失细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法为：通过基因打靶技术使宿主细胞中RIPLET基因编码蛋白功能丧失。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备权利要求5所述的特异性靶向RIPLET基因的sgRNA，在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向RIPLET基因的sgRNA寡聚核苷酸；
(2)将步骤(1)制备的双链片段插入到PX459表达质粒载体的多克隆位点，得到同时表达Cas9蛋白基因和打靶sgRNA序列的重组载体；
(3)将步骤(2)制备的重组载体转染宿主细胞，用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选杀死阴性细胞，随后通过亚克隆的方法获得单个细胞株，从而获得RIPLET基因功能缺失细胞系。
9.如权利要求8所述的方法制备获得的RIPLET基因编码蛋白功能丧失细胞系。
10.RIPLET基因编码蛋白功能丧失细胞系作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用。
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