[发明专利]RIPLET敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及RIPLET敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用。本发明首先发现，抑制宿主细胞中RIPLET基因表达能促进小核糖核酸病毒科病毒，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制；其次，本发明提供了一种特异性靶向RIPLET的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向RIPLET基因，结合CRISPR‑Cas9技术实现了RIPLET基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小核糖核酸病毒科病毒，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制，提高小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种RIPLET敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用。

背景技术

小核糖核酸(RNA)病毒科是由RNA病毒中最小的类群组成的一科，主要包括肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属以及口疮病毒属，包括塞内卡病毒和口蹄疫病毒。口蹄疫属于口疮病毒属，是一种由口蹄疫病毒引起的重要的感染偶蹄动物的疾病，口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus，FMDV)是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，由结构蛋白VP1-VP4组成。塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)与FMDV同科病毒，其感染猪能够引起与口蹄疫极为类似的临床症状，并且可以引发新生仔猪的急性死亡，对养猪业危害巨大，至今没有用于该病防控的商品化疫苗产品，使得该病的防控形势异常严峻。如何制定有效的诊断和防控策略以及措施来防止塞内卡病毒和口蹄疫病毒的不断流行和扩散是当前亟待解决的问题。开发出有效的疫苗是当前该病防控最有效的举措。而选取病毒高效繁殖的细胞系是制备有效疫苗的前提，急需开展相关工作。

其中，基因编辑技术是通过分子生物学方法对各类细胞中基因进行定向、精准的突变、修饰或编辑的技术。该技术已被广泛用于疾病治疗、抗病育种、遗传工程改造等研究领域。基因编辑技术不断发展成熟，从第一代的依赖锌指核酸酶ZFN的编辑技术，第二代依赖转录激活样效应因子核酸酶TALEN的编辑技术，到第三代依赖成簇的规律性间隔的短回文重复序列CRISPR-Cas9的编辑技术，历经发展近30年，已经取得了突破性的进展。第三代基因编辑技术CRISPR-Cas9是利用小分子sgRNA进行靶基因编辑的一种定向基因组编辑技术。该技术较前两代编辑技术更加便捷、高效、精准、稳定，而且相关使用成本费用更加低廉。为基因组定向改造、修饰、调控和应用等带来了突破性革命，在医学与生命科学各大领域具有广阔的应用前景。

本发明首先发现，抑制宿主细胞中RIPLET基因的表达能促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制；其次，本发明提供了一种特异性靶向RIPLE T基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向RIPLET基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了RIPLET基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制，提高小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。

发明内容

针对上述问题，本发明首先发现，抑制宿主细胞中RIPLET基因的表达能促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制；其次，本发明提供了一种特异性靶向RIPLET基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向RIPLET基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了RIPLET基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制，提高小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种使RIPLET基因编码蛋白的功能丧失制备促进小核糖核酸病毒科病毒复制的细胞系的应用。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒包括口蹄疫病毒、塞内卡病毒。