[发明专利]一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法

说明书

本发明公开了一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法，属于植物组织培养技术领域。选择薄皮核桃的健康青皮果实，清洗后用质量浓度75％的酒精消毒，在超净台内，切去部分青皮露出种壳，撬开后将不带子叶的种胚接种至培养基，培养第28d时污染率、褐化率、褐死率均为0、存活率为100％，种胚生长良好。本发明未用剧毒试剂升汞和有刺激性的次氯酸钠消毒、消毒试剂未接触种胚、消毒后未用无菌水漂洗、接种时无需将青皮全部去除和将种壳夹开；省时省力省水省试剂省成本、安全环保、优质高效，适于科研和工厂化组培育苗，为核桃继代增殖及建立叶片再生体系用于遗传转化和基因编辑培育新品种奠定技术基础，也可用于其他植物果实种胚的接种。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体的说是涉及一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法。

背景技术

植物组织培养技术是植物快繁、种质保存和遗传改良培育新品种的重要技术，而外植体接种是实现组培快繁的第一关，种胚是常用的外植体，尤其是杂交育种后代。

目前，生产和研究中常用流水冲洗外植体后，用酒精和升汞组合、酒精和次氯酸钠组合对外植体进行消毒，再用无菌水漂洗，然后将消毒后的外植体接种到培养基上。但是，升汞毒性剧烈，使用不当易导致外植体死亡，且使用含有重金属汞离子的废液处理不当会引发环境污染，使用剧毒药品需要报备且在贮存和使用过程中存在安全隐患，因此在使用时较为不便；次氯酸钠相比升汞较为安全，但因为其刺激性、腐蚀性和氧化性强，接触外植体时易使外植体表面损伤褐化，对于幼嫩组织尤为明显，吸入氯气同样危害操作者的健康。

对于核桃而言，种胚外有种壳、种壳外有青皮，按照传统的接种方法，需经过水洗→使用升汞或次氯酸钠溶液消毒→无菌水漂洗→使用酒精溶液消毒→无菌水漂洗→去掉全部青皮→夹开种壳→取出不带子叶的种胚→使用升汞或次氯酸钠溶液消毒→无菌水漂洗→使用酒精溶液消毒→无菌水漂洗→接种的步骤，存在如下问题：(1)传统消毒方法是在超净台内，将带青皮的核桃放到经过高压灭菌的烧杯中消毒，由于带青皮的核桃直径能达5cm左右，用1000mL的烧杯每次只能消毒几个核桃，消毒效率低。(2)用刀去除青皮时费工费力，而且即便是带着乳胶手套，也容易使手因粘有核桃酚氧化后形成核桃醌而成棕褐色，很难洗掉；(3)由于青皮不容易彻底去除，不易被消毒剂消毒、不易清洗干净，进而容易造成污染，给接种人员带来了操作上的不便；(4)用核桃夹夹开核桃种壳后再取种胚接种的方法，步骤繁琐而难度大且易污染；(5)消毒后无菌水漂洗费水费时且增加种胚污染风险；综上可知，传统的种胚接种方法对于核桃而言操作难度较大、费时、费力、费水、费试剂、成本高、还会造成对环境的污染以及种胚本身的污染，进而损失材料和时间导致不能高效优质完成接种目标，影响组培快繁的后续环节、影响遗传转化或基因编辑培育新品种、影响科研和生产计划，造成经济损失。

因此，提供一种不用在超净台内进行消毒、不用升汞和次氯酸钠消毒、不用彻底去除青皮、不用核桃夹夹开核桃、消毒后无需无菌水漂洗的接种核桃种胚的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法，是一种不用在超净台内进行消毒、不用升汞和次氯酸钠消毒、消毒试剂不直接接触种胚、不用彻底去掉青皮和种壳、不用接种子叶、消毒后不用无菌水漂洗，即可有效完成核桃接种的方法。采用本发明方法，种胚在接种后零污染、零褐化、零褐死且正常萌发生长，达到省时省力省水省试剂省成本、安全环保、优质高效完成核桃的种胚作外植体的接种环节，为后续的核桃继代增殖及建立叶片再生体系用于遗传转化和基因编辑培育新品种奠定坚实的技术基础，也可用于其他植物果实中种胚的接种。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种薄皮核桃的带青皮果实中种胚的接种方法，具体步骤如下：

(1)选取薄皮核桃的带青皮的饱满、无病虫害、无明显机械损伤的健康果实；

(2)将果实清洗后备用；