[发明专利]一种以磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶C的方法

权利要求书

1.一种以环氧基修饰的磁性壳聚糖纳米粒子为载体的固定化磷脂酶C的方法，其特征通过以下步骤实现：

步骤一：在氮气保护下向烧杯中加入FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O，连续搅拌，逐滴加入28％的氨水并在50℃下加热，持续反应一段时间至颜色不再改变，冷却至室温后磁分离，制备的Fe₃O₄磁性纳米粒子用去离子水多次洗涤至中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存；

步骤二：20mL 25％氨水与2mg单宁酸在室温下搅拌2h，随后加入30mL0.1mol/L HCL终止反应，并在通风橱中蒸发24h；离心后得到的氨基化单宁酸在真空干燥箱中至完全干燥；将2mg氨基化单宁酸与4mg Fe₃O₄磁性纳米离子溶解于pH6.8磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀后在振荡培养箱中200rpm下反应2h，制备的氨基单宁酸磁性粒子用去离子水多次洗涤至中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存；

步骤三：将0.3g CS溶于50mL 1％的醋酸溶液中搅拌30min，再加入50mL1mol/L的NaOH溶液搅拌30min；加热至45℃并加入2mL环氧氯丙烷反应2h，随后加入6mL 37％的丙酮和3.8g/LNaBH₄溶液，反应30min再后加入6mL环氧氯丙烷，此时混合物在25℃下反应18h；制备出醛基活化的壳聚糖用去离子水多次洗涤至中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存；

步骤四：将50mL 5000U/mL PLC与0.45mg壳聚糖和1g磁性氨基化单宁酸粒子加入到100mL的pH10碳酸氢盐缓冲溶液中，搅拌30min后至振荡培养箱中200rpm下反应24h，磁分离后制备出的固定化磷脂酶C先用碳酸氢盐缓冲溶液洗涤三次，再用去离子水洗涤至pH为中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存；

步骤五：磁性单宁酸-壳聚糖粒子载体作为载体，在反应温度50℃，反应时间为3h，PLC添加量为2000、3000、4000、5000、6000、7000和800U/mL的条件下时，考察PLC添加量对固定化酶的活力的影响。保证其他条件不变调整反应温度分别为35、40、45、50、55和60℃，考察反应温度对固定化酶的活力的影响。保证其他条件不变调整反应时间分别为2、3、4、5、6、7和8h，考察反应时间对固定化酶的活力的影响；

步骤六：分别选用磁性固定化PLC和游离PLC，对100g毛油进行脱胶反应2h，在60℃条件下，pH 4～8的范围分别进行试验，测定游离酶和固定化酶的酶活力。在pH7.0、40～80℃的范围进行试验，测定游离酶和固定化酶的酶活力；

步骤七：在最适pH和最适温度的条件下，将固定化磷脂酶C应用在大豆毛油脱胶中，重复使用8次并测定固定化酶的酶活力重复使用效果。

2.根据权利要求1所述的一种磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶C的方法，其特征在于步骤五中最佳固定化条件为PLC添加量5000U/mL，反应温度50℃，反应时间3h。

3.根据权利要求1所述的一种磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶C的方法，其特征在于步骤六中最适pH和最适温度分别为7.0和65℃。

4.根据权利要求1所述的一种磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶C的方法，其特征在于步骤七中固定化酶重复使用7次仍保留79％的相对活力。