[发明专利]一种以磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶C的方法

说明书

本发明涉及磁性固定化酶领域，公开了一种以磁性单宁酸‑壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶C的方法。采用氨基修饰处理单宁酸，醛基活化处理壳聚糖，制备了磁性单宁酸壳聚糖粒子，以此载体与磷脂酶C结合得到固定化酶。固定化过程中，醛基壳聚糖作为交联剂，大量的醛基分别与改性后单宁酸的氨基和磷脂酶C非活性中心上的氨基反应，分别生成席夫碱键，以此方法最终生产出一种稳定性和重复使用性较好的固定化磷脂酶C。本发明的重点集中在解决固定化过程中活性中心的侵占而导致的催化活性的降低；两种天然物质的应用，使载体具有更好的生物相容性，避免了常规载体的对环境的污染，对生物催化剂的产业化应用具有重要的指导意义。

技术领域

本发明涉及一种固定化磷脂酶C的方法，尤其涉及一种以引入磁性的单宁酸-壳聚糖粒子的共价固定磷脂酶C的方法。

背景技术

单宁酸(tannic acid，TA)是植物的次生代谢产物，由不同酯化程度的乙醇酸和葡萄糖分子组成。单宁酸上的酚羟基可以形成氢键、疏水键等，羟基作为活性基团可以被化学修饰获得更多的反应位点，从而拓展其应用方向，为提高单宁酸与其他物质反应所生成化学键的强度，可进行氨基改性得到氨基化单宁酸。可以将氨基化单宁酸与Fe₃O₄磁性纳米粒子结合做固定化磁性载体。

作为自然界唯一一种碱性多糖，壳聚糖(CS)上存在大量活性基团如氨基、羟基。采用高碘酸钠和环氧氯丙烷处理，将羟基改性成环氧基并进一步氧化成醛基，醛基活化的壳聚糖既可以作为磁性载体的一部分，提高载体的反应性和生物相容性，又可以代替戊二醛的交联剂作用，降低固定化酶的过度交联和微毒性。

磷脂酶C(PLC)能够特异性水解磷脂，在对磷脂的水解过程中，主要反应基团为-COOH，而-NH₂位于非活性中心可以作为酶的固定化位点。正因如此，活化后壳聚糖的醛基与PLC的-NH₂反应，避免了固定化过程中对酶活性中心的侵占，从而避免其活性的降低。

因此，选择磁性单宁酸壳聚糖载体与磷脂酶C结合制备固定化酶，能够有效解决游离酶稳定性和重复使用性差的缺陷，维持较高催化活性的前提下，使固定化酶具有高耐受性并可多次磁分离，可以广泛应用于不同类型酶的固定化中，对生物催化剂的产业化应用具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶C的方法。通过对单宁酸的氨基修饰及壳聚糖的醛基活化，得到的具有氨基和醛基磁性单宁酸-壳聚糖载体，其中活化后的壳聚糖即是载体的一部分，又能作为交联剂使载体与磷脂酶C结合。所制备的磁性固定化酶具有较高的稳定性、拓宽的pH和温度区间以及较好的重复使用性，其中适宜pH区间为6.0～7.5，适宜温度区间为50～70℃，重复使用7次，相对活力能够达到79％。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种以磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶C的的方法，包括以下步骤：

(1)Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备

在氮气保护下向烧杯中加入FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O，连续搅拌，逐滴加入28％的氨水并在50℃下加热，持续反应一段时间至颜色不再改变，冷却至室温后磁分离，制备的Fe₃O₄磁性纳米粒子用去离子水多次洗涤至中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存。

(2)单宁酸的氨基修饰与磁性单宁酸粒子的制备