[发明专利]一种胶体金免疫层析试纸、制备方法及应用

说明书

本发明属于免疫层析检测技术领域，公开了一种胶体金免疫层析试纸、制备方法及应用，所述胶体金免疫层析试纸的制备方法包括：胶体金的制备；胶体金最适标记pH浓度的确定；胶体金最适标记蛋白浓度的确定；胶体金标记抗体制备；胶体金层析免疫试纸条的组装；胶体金免疫层析试纸条的性能考察。本发明通过改良标记胶体金的制备方法，采用Tris辅助法制备优质的胶体金，制备猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条，适合于临床粪便样品中轮状病毒的快速检测。本发明基于胶体金的猪轮状病毒胶体金免疫层析快速检测方法，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、简单快捷等特点，可以实现对临床样品的快速检测，适用于轮状病毒性腹泻疾病的快速诊断和流行病学。

技术领域

本发明属于免疫层析检测技术领域，尤其涉及一种胶体金免疫层析试纸、制备方法及应用。

背景技术

目前，猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)是含有11个双链RNA的双股RNA病毒，基因组分为11个基因节段，分别编码6种结构蛋白(VP1-VP4， VP6和VP7)和5或6种非结构蛋白(NSP1-NSP5/6)，PoRV的11个基因之间均易发生重配事件。该病毒通过粪-口途径传播，仔猪易感，可引起仔猪精神烦躁、呕吐、厌食以及严重腹泻等，在引起仔猪生长缓慢的同时，导致高死亡率。育成猪和成年猪通常为隐形感染，引起急性肠胃炎，表现为食欲下降、冷漠和不同程度严重的腹泻。在腹泻仔猪中经常发现病毒、细菌和寄生虫联合猪轮状病毒感染。PoRV感染仔猪呈世界流行，各国猪场中阳性率为3.3～67.3％，对世界养猪业产生了严重的经济损失。国内的病原学检测结果显示，PoRV在我国规模化猪场中普遍存在，仔猪腹泻粪便中阳性率为7.69～28.76％。据2017～2019 年四川地区猪A群轮状病毒的分子流行病学调查显示，猪场RVA阳性率为 62.5％，RVA个体阳性率为32.34％，较2014～2016年四川地区RVA的阳性率 (7.69～26.7％)明显增高。在国外，据研究表明，PoRV感染可能非常普遍，在发达国家的猪群中已经流行了几十年，最近对美国和加拿大猪样本的研究表明， PoRV患病率为46％，其中幼龄(≤3日龄78％)和幼龄(4～20日龄65％)仔猪患病率更高。目前，尚无针对该病毒的有效治疗药物，虽然开发出了相应的疫苗，国内临床应用最广泛的疫苗是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的胃－腹－轮腹泻三联弱毒苗，但由于PoRV区域流行不同和遗传多样性，导致该病毒不能完全被控制，因此当前疫苗的保护作用较有限。轮状病毒基因群、基因型多样及该病毒与猪其他引起肠道症状病毒发病症状相似，在临床上难以辨别，故对本病毒快速准确诊断方法的建立就显得尤为重要。

目前，猪轮状病毒的临床检测，多是借助实验室诊断对病原进行进一步的分析诊断，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)和逆转录-环介导等温核酸扩增技术 (RT-LAMP)、原位杂交技术(ISH)、纳米孔测序等。ELISA技术灵敏度较高，但诊断时间长，操作较繁琐。后者几种检测技术具备很高的灵敏度和特异性，但费用成本较高，且对操作人员技术和检测环境要求较高。上述技术对仪器和分析仪的高要求，限制现场或临床诊断的使用。免疫层析技术，始于20世纪后期，是一种将色谱层析和免疫技术相结合的快速检测技术。目前，常见的标记材料包括胶体金、量子点、时间分辨荧光微球、上转换纳米颗粒、磁性纳米颗粒等。其中，最经典的一种标记检测技术是胶体金免疫层析技术。传统的胶体金免疫层析技术，依靠大量金颗粒聚集达到肉眼可见效果，使得基于胶体金标记的免疫层析检测产品的灵敏度较低，稳定性较差，但由于其检测周期短、成本低、对仪器设备和人员没有特殊要求，在即时快速检测方面发挥着不可替代的作用，发展前景广阔。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有针对猪轮状病毒的临床检测技术中，ELISA技术诊断时间长，操作较繁琐；RT-PCR、RT-qPCR、RT-LAMP、ISH、纳米孔测序等技术费用成本较高，对操作人员技术和检测环境要求较高，且现有技术对仪器和分析仪的高要求，限制现场或临床诊断的使用。