[发明专利]一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法

权利要求书

1.一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将活性氧响应基团引入聚合物，构建活性氧响应聚合物；

(2)利用活性氧响应聚合物装载交联剂，制备位点特异性释放的活性氧响应化学交联剂载体；

(3)将活性氧响应化学交联剂载体与细胞共孵育，经过细胞的内吞作用，载体到达细胞内特定部位，在特定部位微环境中活性氧的刺激下，载体的聚合物发生响应，进行交联剂的释放，原位交联蛋白质复合物；

或将活性氧响应化学交联剂载体静脉注射入活体鼠体内，经血液循环渗透到特定组织或器官，在特定部位微环境中活性氧的刺激下，载体的聚合物发生响应，进行交联剂的释放，原位交联蛋白质复合物；

(4)将细胞、鼠的组织或鼠的器官破碎，提取蛋白质复合物，利用i-FASP(基于离子液体的过滤辅助样品制备方法)进行样品预处理，结合液质联用技术，对蛋白质复合物进行原位分析。

2.如权利要求1所述的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：所述的活性氧响应基团包括：硫醚、缩硫酮、单碲基团、芳香硼酸酯中一种或多种结合；

所述的聚合物包括：主要为碳链高分子、杂链高分子、元素有机高分子，如聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚已内酯、聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸、聚乙醇酸、葡聚糖、壳聚糖等中的一种或二种以上；

所述的活性氧响应化学交联剂载体的制备方法包括：乳化溶剂蒸发法(单乳法，双乳法)，纳米沉淀法，乳化溶剂扩散法(单乳法，双乳法)中的一种或二种以上；

所述的交联剂包括：其两侧基团分别为下述任一反应基团的、含碳链间隔臂的有机物：

反应基团为：可与蛋白上氨基反应的琥珀酰亚胺基团、卤代芳烃或亚胺酸酯；或可为与蛋白上巯基反应的马来酰亚胺基团、2-巯基吡啶、硫代磺酸盐、卤代乙酰基或吡啶基二硫化物；或可与蛋白上羧基反应的碳化二亚胺或异氰酸盐；或可与蛋白上糖链反应的酰肼基团；或可与蛋白质中的氨基酸残基发生反应的非特异反应基团的苯基叠氮基团或双吖丙啶。

3.如权利要求2所述的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：所述琥珀酰亚胺基团为磺酸基-琥珀酰亚胺和羟基-琥珀酰亚胺中的一种或两种以上；所述苯基叠氮基团为硝基苯叠氮基团和卤代苯叠氮基团中的一种或两种以上。

4.如权利要求1所述的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：所述细胞包括：肿瘤细胞(敏感株，耐药株)、炎症细胞、激活免疫细胞中的一种或二种以上；

所述活体鼠为耐药细胞移植瘤鼠、敏感细胞移植瘤鼠和诱导炎症鼠模型中的一种或二种以上；

所述细胞内特定部位包括：肿瘤细胞线粒体，炎症细胞和激活免疫细胞的质膜、吞噬体、溶酶体、核小体中的一种或二种以上；

所述特定组织或器官包括：血液循环1-24h期间的肿瘤组织，以及具有炎症的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏中的一种或二种以上。

5.如权利要求1或4所述的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：所述活性氧响应化学交联剂载体与细胞共同孵育包括：载体与细胞在细胞培养基中共孵育1-12小时，并收集细胞。

6.如权利要求1所述的蛋白质复合物原位分析方法，其特征在于：

所述细胞、鼠的组织或器官破碎，提取蛋白质复合物过程包括：

细胞中加入含蛋白酶抑制剂cocktail的离子液体，超声破碎细胞，10000-16000g离心5-30min，取出上清液样品；

鼠的组织或器官取出后，清洗干净、剪碎，加入含蛋白酶抑制剂cocktail的离子液体，冰上研磨匀浆裂解，将匀浆400-1000g离心5-10min，抛弃细胞碎片，上清液进行超声破碎提取，再次进行10000-16000g离心5-30min，取出上清液样品。