[发明专利]一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法

说明书

本发明涉及一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法。在该方法中，将活性氧响应基团引入聚合物，利用聚合物装载交联剂，制备位点特异性释放的活性氧响应化学交联剂载体。将活性氧响应化学交联剂载体与细胞共孵育，经过细胞内吞作用，载体到达细胞内特定部位；或将活性氧响应化学交联剂载体静脉注射入活体鼠体内，经血液循环渗透到特定组织或器官。在特定部位微环境中高浓度活性氧的刺激下，载体的聚合物发生响应，进行交联剂的快速、定点释放，原位交联蛋白质复合物。将细胞、组织、器官破碎，进行蛋白质复合物的提取，随后利用i‑FASP进行样品预处理，结合液质联用技术，对高浓度活性氧下蛋白质复合物进行原位分析。

技术领域

本发明涉及一种基于活性氧响应载体的蛋白质复合物原位分析方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

蛋白质组是指在一种细胞、组织或生物体中完整基因组所表达的全套蛋白质。蛋白质组学就是通过研究细胞、组织或生物体中蛋白质组的组成及其变化规律，从而实现对生物学功能的研究，主要研究内容包括：蛋白质丰度、亚细胞定位、周转代谢、相互作用和翻译后修饰等(Nat Rev Mol Cell Bio,2015,16(5),269-280)。

研究蛋白质结构的常见方法有X射线晶体、核磁共振波谱和冷冻电镜。但是X射线晶体需要高纯结晶蛋白；核磁共振波谱需要纯蛋白溶在特定溶剂，并且适用于小分子量蛋白；冷冻电镜破坏蛋白质复合物天然构象。研究蛋白质-蛋白质相互作用的常见方法有亲和纯化质谱、酵母双杂交、免疫共沉淀和邻近标记。亲和纯化质谱和免疫共沉淀都不能捕获瞬时或弱的相互作用，不能区分直接或间接相互作用，而且会导致蛋白质相互作用的重组。酵母双杂交将蛋白与结构域融合，可能改变空间构象。邻近标记在活体和组织中，标记探针递送困难。

而化学交联质谱不仅能够提供蛋白质-蛋白质相互作用信息，而且能够补充蛋白质构象信息。它能够捕获瞬时或弱的相互作用，提供相互作用界面信息，而且能够对于天然环境下的大规模蛋白质复合物进行分析。

当前交联剂发展迅速，出现大量不同臂长、不同反应基团的化学交联剂，但是分别有溶解度差、极易水解、不能捕获特定位点蛋白质复合物等缺点，并且交联剂在活体中由于血液循环里被猝灭和清除，导致无法用于活体的蛋白质复合物原位分析。因此本专利利用载体进行交联剂递送，能够保护交联剂、改善交联剂溶解度、实现靶向交联。

常规载体有高分子聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒、无机非金属纳米颗粒(介孔二氧化硅、碳纳米管)、金属纳米颗粒(纳米金)等，它们各自具有稳定性好、生物相容性好、高比表面积、易修饰等优点，但是它们作为药物载体的共同点都是缓释。

重要生物标志物活性氧在肿瘤细胞、炎症细胞、激活免疫细胞中存在高表达。细胞内活性氧产生的主要途径有线粒体呼吸链途径和NADPH氧化酶途径。线粒体呼吸链是细胞内活性氧产生的主要来源，约90％活性氧产生于线粒体，由于肿瘤细胞的异常增殖和线粒体功能障碍，使得其活性氧浓度高达100μM(Asian J Pharm Sci,2018,13(2),101-112)。NADPH氧化酶是活性氧在一些免疫细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞)中的主要来源，当细胞膜受到刺激(微生物、非颗粒)后，胞质内的NADPH氧化酶复合物的组分向吞噬体膜、核内体膜和质膜上转移，组合成完整的NADPH氧化酶复合物，引发呼吸爆发机制，产生大量ROS，引起免疫反应。

因此，为了实现载体快速释放交联剂进行蛋白质复合物的原位交联，利用内源性高表达的活性氧设计出活性氧响应载体，它能够在高浓度活性氧刺激下，快速并且位点特异性释放交联剂进行蛋白质复合物交联。

在本专利中，针对现有化学交联剂溶解度差、极易水解、无法靶向交联等问题，以及现有载体缓释的问题，利用特定细胞、组织和器官内源性高表达活性氧这一特点，发展出基于活性氧响应化学交联剂载体的蛋白质复合物原位分析方法，以实现高浓度活性氧下蛋白质复合物的原位分析。

发明内容