[发明专利]一种农杆菌转化裂殖壶菌的方法和应用

说明书

本发明公开了一种农杆菌转化裂殖壶菌的方法和应用，所述转化方法是将外源基因导入农杆菌，利用农杆菌将外源基因导入裂殖壶菌，使裂殖壶菌获得相关外源基因的功能。本发明将转入G418抗性基因表达盒的农杆菌AGL‑1与裂殖壶菌HX‑308共培养，使得外源基因成功转化到裂殖壶菌HX‑308，并实现基因的定点敲除。本发明实验操作非常简单，有效节约了时间和成本，不仅可以实现农杆菌转化裂殖壶菌，更重要的可以实现基因敲除，通过基因敲除，可以在裂殖壶菌体内构建了一套完整的遗传操作系统。本发明使用较短的同源臂即可完成定点整合，在一般的真菌转化中可能需要2‑3kb的同源臂，为简化裂殖壶菌的遗传操作奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种农杆菌转化裂殖壶菌的方法和应用。

背景技术

目前主要是通过电击将外源DNA转化进入裂殖壶菌体内，但是电击转化的条件千差万别，已经报道的电击电压、电阻和电容各不相同，并且电击转化需要高浓度线性化处理的外源DNA，工作量巨大。此外，电击转化的同源重组效率非常低，不利于基因敲除。

农杆菌转化系统是一种天然存在的基因转化系统，可将肿瘤诱导(Ti)质粒上的T-DNA转化进入植物细胞。T-DNA两端存在两个25bp的重复序列，分别为左边界和右边界，转化过程还需要Ti质粒上其它区域中的元件如毒性区(Vir区)以及冠瘿碱代谢基因编码区参与辅助DNA的转化。

当植物组织受伤时，伤口会分泌含有酚类物质的汁液，农杆菌感受到酚类物质的趋化性后开始向伤口部位迁移。迁移到伤口位置后，Ti质粒上的各种毒力基因和辅助基因开始表达。其中，VirD1和VirD2在T-DNA的右边界处切割产生单链DNA缺口，VirD2与切口处的T-DNA单链末端结合，T-DNA单链开始与互补链解链，VirE2与解链部分的T-DNA单链结合将其包裹，完全解链后最终形成T-复合体。T-复合体在一系列蛋白的协助下被转运到植物细胞内，接着进入细胞核插入到植物细胞的染色体中。

农杆菌不仅可以将T-DNA转入植物细胞染色体，还可以对别的生物如细菌和真菌进行转化。例如，Bundock等在1995年成功使用根癌农杆菌转化了酵母菌，De-Groot等于1998年首次成功利用农杆菌侵染了黑曲霉(Aspergillusniger)等6种丝状真菌。AGL-1菌株是根癌农杆菌中重要的成员之一，据报道其已成功转化曲霉、木霉、侧耳等数十种真菌。裂殖壶菌(Schizochytrium)又称裂壶藻，属于网粘菌门(Labyrinthulomycota)、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形。现有技术中报道的Schizochytriumsp.HX-308是从海水中分离出的裂殖壶菌菌株，该菌株的生物量可达134.5g/L，油脂产量可达80.14g/L，有着巨大的商业应用价值，目前还没有在裂殖壶菌中形成一套完整的遗传操作系统及其定点敲除。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种农杆菌转化裂殖壶菌的方法，本发明首次利用农杆菌将重组基因转化进入裂殖壶菌，为裂殖壶菌的DNA转化和代谢工程改造提供了新的方法和有效的思路。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种农杆菌转化裂殖壶菌的方法，使用农杆菌将外源基因转化进入裂殖壶菌体内，使裂殖壶菌获得导入外源基因的功能。

其中，所述农杆菌原始菌株为AGL-1。

作为优选，所述农杆菌为被转入G418抗性基因表达盒的农杆菌AGL-1。

其中，所述G418抗性基因表达盒的启动子为裂殖壶菌的内源性启动子P2845，所述G418抗性基因为NeoR，所述G418抗性基因表达盒的终止子为裂殖壶菌的内源性终止子T2845。

其中，所述G418抗性基因表达盒的完整序列如序列SEQ ID NO.1所示。

其中，所述所述裂殖壶菌菌株为HX-308。