[发明专利]一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法

权利要求书

1.一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)农杆菌活化培养：取出-80℃保存的电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融；待感受态解冻时，加入编辑载体质粒，混匀，置于冰上；将混匀的感受态转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1mL的YEB液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5-2h；8,000rpm离心菌体弃掉上清培养基，然后用200μL的YEB液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/L利福平、50mg/L链霉素和75mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上28℃倒置黑暗培养2-3d；

(2)农杆菌悬浮液的制备：将步骤(1)的菌体加入含0.2mmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中，调节菌液的OD600为0.6-0.8，混匀，得农杆菌侵染菌液；

(3)外植体的准备：取饱满的烟草种子，在超净工作台中，用75％酒精清洗种子30s，水清洗2次，再用1％AgNO₃溶液消毒10min，水清洗4-5次，再将种子在灭菌滤纸上吸干水分后进行接种；将种子接种到MS培养基中，温度25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d，培养60d，得幼苗；

(4)侵染：将步骤(3)得到的幼苗，利用手术刀将其叶片切成1cm²的叶盘，将叶盘置于步骤(2)制备好的农杆菌悬浮液中浸泡10min；

(5)共培养：浸泡结束后，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至在共培养基上进行暗培养，共培养培养基为MS共培养基1号或MS共培养基2号上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d；

(6)植株再生：

将步骤(5)共培养3d的叶盘从培养箱中取出，转置于MS继代培养基上，28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d，每7-10d更换一次培养基，逐渐形成分化芽；

将上述已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于MS生根培养基上进行培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养7-10d，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高；

将上述分化芽切下，插入含有250mg/L羧苄青霉素和75mg/L卡那霉素的MS培养基上进行生根培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d，7-10d即可生根。

2.根据权利要求1所述的提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，其特征在于，步骤(1)中的编辑载体质粒的构建方法如下：

设计CRISPR/Cas9系统敲除目的基因的sgRNA序列、上游引物以及下游引物，双链退火并与预先用BsaI酶切过的骨架载体连接，连接产物转化大肠杆菌培养后进行阳性克隆的PCR扩增、克隆和测序筛选，从测序正确的菌中提取纯化质粒，-20℃冰箱保存备用。

3.根据权利要求2所述的提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，其特征在于，目的基因为烟草PDS基因，其中：

PDS-sgRNA序列为：GCTGCATGGAAAGATGATGATGG；

sgRNA PCR引物为：

PDS-sgRNA上游引物：GATTGGCT GCATGGAAAGATGATGA；

PDS-sgRNA下游引物：AAACTCATCATCTTTCCATGCAGCC。

4.根据权利要求1所述的提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，其特征在于，步骤(1)中的连接体系为：酶切载体100ng，退火产物2μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer1μL，ddH₂O补齐至10μL，16℃连接30min。