[发明专利]一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，包括以下步骤：(1)农杆菌活化培养；(2)农杆菌悬浮液的制备；(3)外植体的准备；(4)侵染；(5)共培养；(6)植株再生。本发明利用基因编辑技术，通过添加乙酰丁香酮，提高烟草外植体产生愈伤组织比率，可将烟草组织培养产生愈伤组织的时间缩短至20‑25天，分化苗转化率提高至89％以上，显著提高了烟草的基因编辑效率和组织培养效率。

技术领域

本发明涉及植物细胞工程技术领域，特别涉及一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法。

背景技术

植物和微生物可以通过一些化学物质分子，以化学的方式发生相互作用。农杆菌对酚类化合物具有趋化性，而且这种趋化性依赖于VirA和VirG基因。烟草叶子的受伤部位比非受伤叶子具有明显的诱导作用，并从受伤植物细胞中分离提取出了乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，将其作为趋化物来识别。AS作为诱导性最好的酚类化合物，其作用机理主要是通过诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达，促进T-DNA的加工与转移，从而使农杆菌T-DNA更易进入植物基冈组并与其整合。农杆菌Ti或Ri质粒的Vir区编码产物负责接收外界信号、T-DNA的加工、转移及整合等功能，对菌种的侵染力起决定性的作用。

AS是双子叶植物细胞壁合成的前体，一般认为细胞渗出液中含有0.5-1.0μmol/L的AS即可诱导农杆菌Vir区基因活化，但最适诱导浓度要更高。因此，大多双子叶植物的遗传转化仍需补充AS以提高转化率，也有少数双子叶植物在受伤的组织中可以产生一些酚类物质，这些酚类物质已能起到活化基因的作用，所以在遗传转化中加入AS转化效率并没有明显提高。

农杆菌介导的植物转基因的效率和T-DNA进入植物细胞是多个物理-化学因素和生理条件共同作用的结果，多种因素影响转化效率。乙酰丁香酮(AS)是酚类化合物的一种，能有效促进农杆菌将外源基因转入植物体内。目前，AS在烟草基因编辑遗传转化及组织培养中的使用未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，其克服了现有技术的上述缺陷，解决了基因编辑技术在烟草中使用时遗传转化率和组织培养效率较低的问题。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种提高烟草基因编辑遗传转化率及组织培养效率的方法，包括以下步骤：

(1)农杆菌活化培养：取出-80℃保存的电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融；待感受态解冻时，加入编辑载体质粒，混匀，置于冰上；将混匀的感受态转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1mL的YEB液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5-2h；8,000rpm离心菌体弃掉上清培养基，然后用200μL的YEB液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/L利福平、50mg/L链霉素和75mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上28℃倒置黑暗培养2-3d；

(2)农杆菌悬浮液的制备：将步骤(1)的菌体加入含0.2mmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中，调节菌液的OD600为0.6-0.8，混匀，得农杆菌侵染菌液；

(3)外植体的准备：取饱满的烟草种子，在超净工作台中，用75％酒精清洗种子30s，水清洗2次，再用1％AgNO₃溶液消毒10min，水清洗4-5次，再将种子在灭菌滤纸上吸干水分后进行接种；将种子接种到MS培养基中，温度25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d，培养60d，得幼苗；

(4)侵染：将步骤(3)得到的幼苗，利用手术刀将其叶片切成1cm²左右的叶盘，将叶盘置于步骤(2)制备好的农杆菌悬浮液中浸泡10min；