[发明专利]一种鉴定产毒型艰难梭菌及其毒素基因分型的方法

权利要求书

1.一种用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，所述特异性引物和探针的组合包括以下引物和探针：

引物C5：5’-GATGTTGATATGTTACC-3’

引物C6：5’-CTACTTTGAACTTCTTC-3’

tcdB1/2探针T4：5’-AGTCTATAGAGAAACCTAGTTCAGT-3’

tcdB3/4探针T19：5’-AAAGATATAAATAAGCCTGATTCA-3’

引物C34：5’-ATGAGCAAAATATTTAAATC-3’

引物C32：5’-TATTTTGATGATTCTGGT-3’

tcdB2/4探针T27：5’-TGTGATGAAGTCAGGATATACTGA-3’

引物C18：5’-CTATATTTGATACTGTAAATGG-3’

引物C20：5’-GCTACACTTAAATTACTAAGAG-3’

通用探针C19：5’-TATAAAAAATGCAGCATTTAAAG-3’

其中，tcdB1/2探针T4、tcdB3/4探针T19、tcdB2/4探针T27和通用探针C19各自带有荧光报告基团以实现彼此区分。

2.根据权利要求1所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，其中，所述tcdB1/2探针T4、tcdB3/4探针T19、tcdB2/4探针T27和通用探针C19的5’端带有荧光报告基团，3’端带有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求1或2所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，其中，所述特异性引物和探针的组合包括以下引物和探针：

引物C5：5’-GATGTTGATATGTTACC-3’

引物C6：5’-CTACTTTGAACTTCTTC-3’

tcdB1/2探针T4：5’FAM-AGTCTATAGAGAAACCTAGTTCAGT-TAMRA 3’

tcdB3/4探针T19：5’VIC-AAAGATATAAATAAGCCTGATTCA-BHQ1 3’

引物C34：5’-ATGAGCAAAATATTTAAATC-3’

引物C32：5’-TATTTTGATGATTCTGGT-3’

tcdB2/4探针T27：5’ROX-TGTGATGAAGTCAGGATATACTGA-BHQ2 3’

引物C18：5’-CTATATTTGATACTGTAAATGG-3’

引物C20：5’-GCTACACTTAAATTACTAAGAG-3’

通用探针C19：5’Cy5-TATAAAAAATGCAGCATTTAAAG-BHQ2 3’。

4.一种用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的试剂盒，该试剂盒包括：如权利要求1-3中任一项所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合。

5.根据权利要求4所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的试剂盒，其进一步包括执行实时荧光定量PCR扩增反应所需的试剂。

6.一种鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法，其包括使用如权利要求1-3中任一项所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合进行检测的步骤。

7.根据权利要求6所述的鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法，包括以下步骤：

(1)从待检测的样本中提取DNA；

(2)使用如权利要求1-3中任一项所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，以步骤(1)中DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应；

(3)根据实时荧光定量PCR仪判读各扩增反应的Ct值进行鉴别。