[发明专利]一种鉴定产毒型艰难梭菌及其毒素基因分型的方法

说明书

本发明提供了一种鉴定产毒型艰难梭菌及其毒素基因分型的方法。该方法使用特异性引物和探针的组合，利用实时荧光定量PCR技术快速鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型进行甄别。本鉴定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体而言，涉及一种鉴定产毒型艰难梭菌及其毒素基因分型的方法。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile)是目前公认的院内感染和抗生素相关性腹泻的重要病原体之一。艰难梭菌感染可引起伪膜性肠炎、中毒型巨结肠、肠穿孔、弥漫性血管内凝血、肾衰竭和脓毒症等严重的并发症。因此有必要建立一种快速鉴定艰难梭菌的试剂方法，对临床艰难梭菌感染的确诊及用药具有重要的指导意义。

目前鉴别艰难梭菌的分子生物方法有ELISA、免疫胶体金等。以上各种方法虽然可能在临床上提供较好的价值，但因操作繁琐、灵敏度低等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。

因此有必要寻找新的快速鉴定艰难梭菌的方法。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合。

本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的试剂盒。

本发明的再一个目的是提供一种鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法。该方法使用上述特异性引物和探针的组合，利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术快速鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型进行甄别。本鉴定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。

一方面，本发明提供了一种用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，所述特异性引物和探针的组合包括以下引物和探针：

引物C5：5’-GATGTTGATATGTTACC-3’

引物C6：5’-CTACTTTGAACTTCTTC-3’

tcdB1/2探针T4：5’-AGTCTATAGAGAAACCTAGTTCAGT-3’

tcdB3/4探针T19：5’-AAAGATATAAATAAGCCTGATTCA-3’

引物C34：5’-ATGAGCAAAATATTTAAATC-3’

引物C32：5’-TATTTTGATGATTCTGGT-3’

tcdB2/4探针T27：5’-TGTGATGAAGTCAGGATATACTGA-3’

引物C18：5’-CTATATTTGATACTGTAAATGG-3’

引物C20：5’-GCTACACTTAAATTACTAAGAG-3’

通用探针C19：5’-TATAAAAAATGCAGCATTTAAAG-3’

其中，tcdB1/2探针T4、tcdB3/4探针T19、tcdB2/4探针T27和通用探针C19各自带有荧光报告基团以实现彼此区分。

本发明中，所述荧光报告基团是指吸收一定波长的光子后发射特定波长光波的一类小分子化合物，其实例包括但不限于，FAM、VIC、ROX、Cy5等常用荧光修饰基团，见下表1：

表1荧光定量PCR常用荧光修饰基团信息

在一个实施方式中，所述tcdB1/2探针T4、tcdB3/4探针T19、tcdB2/4探针T27和通用探针C19的5’端带有荧光报告基团，3’端带有荧光淬灭基团。