[发明专利]一种基于Zm00001d008708基因创制玉米矮化材料的方法

权利要求书

1.一种基于Zm00001d008708基因创制玉米矮化材料的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)针对基因Zm00001d008708设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位点；

所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：

5’-TCCAGCACCAGCGGTTCTTCTGG-3’；SEQ ID NO.3；和

5’-CCGTGCGGAGGCTGACTGAAAAC-3’；SEQ ID NO.4；

(2)以pCBC-MT1T2质粒为模板，MT1T2-F，MT1T2-F0，MT2T2-R0，MT2T2-R为引物，PCR扩增目的片段；

所述引物序列如下：

MT1T2-F：5’-AATAATGGTCTCAGGCGCCAGCACCAGCGGTTCTTC-3’；SEQ ID NO.5；

MT1T2-F0：5’-GCCAGCACCAGCGGTTCTTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；SEQ ID NO.6；

MT1T2-R0：5’-TGCGGAGGCTGACTGAAAACGCTTCTTGGTGCC-3’；SEQ ID NO.7；

MT1T2-R：5’-ATTATTGGTCTCTAAACTGCGGAGGCTGACTGAAAA-3’；SEQ ID NO.8；

(3)将步骤(2)获得的目的片段与载体pBUE411进行酶切连接，构建得到Zm00001d008708基因编辑载体pBUE411-2gR-Zm00001d008708；

所述酶切连接反应体系如下：目的片段2μL，pBUE411 2μL，10xNEB T4 Buffer 1.5μL，10xBSA 1.5μL，BsaI 1μL，T4 Ligase 1μL，ddH₂O 6μL，Total 15μL；

(4)将步骤(3)获得的基因编辑载体pBUE411-2gR-Zm00001d008708转入农杆菌LBA4404，进行玉米遗传转化，经筛选鉴定获得玉米矮化材料。

2.根据权利要求1所述的一种基于Zm00001d008708基因创制玉米矮化材料的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR反应体系为：pCBC-MT1T2质粒1μL，MT1T2-F 0.5μL，MT1T2-F00.5μL，MT1T2-R0 0.5μL，MT1T2-R 0.5μL，2×Mix 10μL，ddH₂O 7μL；PCR扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。