[发明专利]一种基于Zm00001d008708基因创制玉米矮化材料的方法

说明书

本发明公开了一种基于Zm00001d008708基因创制玉米矮化材料的方法，属于基因工程技术领域。本发明公开的一种基于Zm00001d008708基因创制玉米矮化材料的方法，通过CRISPR/Cas9技术对玉米Zm00001d008708基因进行基因编辑，并进一步筛选获得含目的基因缺失片段的突变体材料，这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种利用基因编辑技术基于Zm00001d008708基因创制玉米矮化材料的方法。

背景技术

二十世纪玉米产量的提高主要依赖提高单位面积内玉米的种植密度，但是密度过高随之而来的就是倒伏的风险，可能会降低产量，因此在一定程度上降低玉米株高有助于提高玉米产量。上世纪60年代末，闻名于世的“绿色革命”掀起了半矮化植株可以提高产量的狂潮。在“绿色革命”期间成功创制了半矮化水稻和小麦的高产品种。在过去的几十年中许多玉米矮化突变体被鉴定，但没有完全应用到玉米育种中。

传统矮杆玉米的创制主要是通过回交转育的方法，往往需要经过6个回交世代，不仅耗时长，同时经常伴随基因冗余，导致一些非目标性状的导入，限制了改良材料的应用效果。Zm00001d008708是一类DUF1421结构家族蛋白，目前功能未知。

因此，提供一种基于Zm00001d008708基因创制玉米矮化材料的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于Zm00001d008708基因创制玉米矮化材料的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于Zm00001d008708基因创制玉米矮化材料的方法，具体步骤如下：

(1)针对基因Zm00001d008708设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位点；

所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：

5’-TCCAGCACCAGCGGTTCTTCTGG-3’；SEQ ID NO.3；和

5’-CCGTGCGGAGGCTGACTGAAAAC-3’；SEQ ID NO.4；

(2)以pCBC-MT1T2质粒为模板，MT1T2-F，MT1T2-F0，MT2T2-R0，MT2T2-R为引物，PCR扩增目的片段；

所述引物序列如下：

MT1T2-F：5’-AATAATGGTCTCAGGCGCCAGCACCAGCGGTTCTTC-3’；SEQ ID NO.5；

MT1T2-F0：5’-GCCAGCACCAGCGGTTCTTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；SEQ ID NO.6；

MT1T2-R0：5’-TGCGGAGGCTGACTGAAAACGCTTCTTGGTGCC-3’；SEQ ID NO.7；

MT1T2-R：5’-ATTATTGGTCTCTAAACTGCGGAGGCTGACTGAAAA-3’；SEQ ID NO.8；

所述PCR反应体系为：pCBC-MT1T2质粒1μl，MT1T2-F 0.5μl，MT1T2-F0 0.5μl，MT1T2-R0 0.5μl，MT1T2-R 0.5μl，2×Mix 10μl，ddH₂O 7μl；PCR扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。

(3)将步骤(2)获得的目的片段与载体pBUE411进行酶切连接，构建得到Zm00001d008708基因编辑载体pBUE411-2gR-Zm00001d008708；