[发明专利]一种原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法

说明书

本发明提供了一种原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法，其中，所述原代汗腺条件细胞培养基包括：细胞基础培养基、血清、Glutamax、缓冲液、细胞培养添加剂、青霉素/链霉素、表皮生长因子、碱性成纤维细胞因子、非必需氨基酸、胰岛素、ROCK抑制剂及NF‑κB激动剂。本发明在原代汗腺细胞基础培养基中添加有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、NF‑κB激动剂及ROCK抑制剂。通过这些生长因子和小分子的组合，以实现人原代汗腺细胞在二维条件下的体外长期扩增培养，并在传代中维持其自身的生物学特性，延缓原代汗腺细胞的衰老进程，为快速大量制备高质量的、可移植用人汗腺细胞，满足大规模临床治疗的需求提供了前提条件。

技术领域

本发明涉及汗腺细胞培养技术领域，特别是涉及一种实现人汗腺细胞体外长期培养扩增的原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法。

背景技术

汗腺是皮肤最为重要的附属器官之一，在物质代谢、水电解质平衡以及维持机体内环境稳态等方面具有举足轻重的作用。然而汗腺的再生能力有限，且创伤后皮肤的瘢痕性修复进一步破坏了汗腺的结构和功能，导致皮肤不能正常排汗，体温调节失衡，给患者带来巨大生理及心理伤害。

当前主要应用生长因子、基因治疗等策略来激活机体原位组织细胞的再生潜能，以实现创伤皮肤的功能性修复。但是大面积烧创伤后创面内残存的汗腺细胞数量不足，再生潜能有限。无法启动创伤修复的级联反应，修复损伤汗腺的结构及功能。因此自体或同种异体汗腺移植成为理想的选择，为解决大面积深度烧创伤患者的康复治疗，恢复其排汗功能带来了新的契机。尽管如此，供体组织来源短缺、原代汗腺获取过程繁杂、汗腺细胞体外增殖能力弱、难以长期扩增培养并维持其生物学特性。这些缺点阻碍了相关技术的进一步临床推广。因此，如何能在体外有效扩增并获得高质量、高纯度的汗腺细胞，以满足大规模临床治疗的需求，是汗腺移植临床应用最为关键的科学问题之一，同时也是研发含汗腺组织工程皮肤必须攻克的难点问题之一。

发明内容

本发明实施例提供了一种实现人汗腺细胞体外长期培养扩增的原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法，以解决现有技术中体外分离培养的汗腺细胞增殖能力弱、难以长期扩增培养并维持其生物学特性的问题。

为了解决上述问题，本申请是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种原代汗腺细胞条件培养基，其中，包括细胞基础培养基、血清、Glutamax、缓冲液、细胞培养添加剂、青霉素/链霉素、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、非必需氨基酸、胰岛素、ROCK抑制剂及NF-κB激动剂。

可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述NF-κB激动剂为佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯。

可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯为0.01～0.05μg/mL

可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述细胞基础培养基为DMEM/F12培养基。

可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述细胞培养添加剂为B27。

可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述ROCK抑制剂为Y-33075。

可选地，所述的原代汗腺细胞条件培养基中，所述表皮细胞生长因子的含量为20～50ng/mL、所述碱性成纤维细胞生长因子的含量为10～20ng/mL、所述Y-33075的含量为0.5～1μM。

第二方面，本发明实施例提供了一种实现人汗腺细胞体外长期培养扩增的条件培养基，其中，包括以下步骤：

取细胞培养皿，加入如上述的原代汗腺细胞条件培养基；

将原代汗腺组织加入所述细胞培养皿中，待汗腺组织贴壁后，补加所述原代汗腺细胞条件培养基，且每隔2～3天换液一次；