[发明专利]一种脐带间充质干细胞的制备方法

说明书

本申请公开了一种脐带间充质干细胞的制备方法。本申请的制备方法包括将华通氏胶剪成不大于2mm³的组织块，采用浓度大于或等于1％的胶原酶在37℃～39℃下进行30‑60分钟消化，分别对获得的悬浮液和消化后组织块进行间充质干细胞培养，获得脐带间充质干细胞。本申请制备方法，采用高浓度胶原酶，在较高温度下对华通氏胶进行快速消化，分别对消化获得的细胞悬浮液和未消化完的组织块进行间充质干细胞培养，结合组织块贴壁培养法和酶消化法的优势，能更高效的制备获得更多数量的脐带间充质干细胞，为脐带间充质干细胞培养提供了一种新的方法和思路。

技术领域

本申请涉及脐带间充质干细胞制备技术领域，特别是涉及一种脐带间充质干细胞的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stromal cells，MSC)目前广泛应用于再生医学的诸多领域。MSC具有自我更新能力，增殖活跃；能分化为成骨细胞、脂肪细胞等多种细胞。此外，MSC还能分泌多种可溶性的生物活性物质，例如细胞因子和生长因子等，发挥抗炎症、促血管新生、抗凋亡和免疫调节等作用。

获得MSC的来源多样，但与骨髓和脂肪组织等相对成熟的组织相比，出生时的胚胎外组织，例如脐带和胎盘的不同部位等，具有更好的前景。这些胚胎外组织易于采集，且量大，不存在伦理问题。

脐带间充质干细胞，就是从脐带组织分离培养获得的间充质干细胞。21世纪以来，出现了大批从脐带组织分离培养MSC的方法。一些方法使用胶原酶和/或透明质酸酶、胰酶及中性蛋白酶等处理脐带的不同部位。酶的处理时间各异，有的长达16小时。此外，组织块培养法也广泛应用于脐带MSC的原代培养。

人脐带间充质干细胞原代分离制备方法主要为组织块贴壁培养法和酶消化法。组织块培养法主要是对脐带组织块进行处理后，采用组织块进行培养获得脐带间充质干细胞，例如专利申请201811409243.5；组织块培养法经济成本低，易于开展，但是耗时长，一般需要两周以上。酶消化培养法主要是对脐带进行组织消化酶处理后，采用消化获得的悬浮液为原材料进行间充质干细胞培养，获得脐带间充质干细胞，例如专利申请201310020489.4；酶消化培养法的原代处理时间更长，消化程度不易把控，消化不够无法得到足够数量的细胞，消化时间过久则会损伤细胞，并且，存在消化液离心时不易分离出细胞的问题。

综上所述，尽管目前已经有很多从脐带分离培养MSC的方法，但是，如何更高效地分离脐带间充质干细胞仍然是脐带间充质干细胞的研究热点。

发明内容

本申请的目的是提供一种改进的脐带间充质干细胞的制备方法。

本申请采用了以下技术方案：

本申请公开了一种脐带间充质干细胞的制备方法，包括将获取自脐带的华通氏胶剪成不大于2mm³的组织块，采用浓度大于或等于1％的胶原酶在37℃～39℃下对华通氏胶组织块进行30-60分钟的消化，分别对消化获得的悬浮液和消化后组织块进行间充质干细胞培养，获得本申请的脐带间充质干细胞。

本申请创造性的采用高浓度的胶原酶，在较高温度下对华通氏胶进行快速消化，并且，分别采用消化获得的细胞悬浮液和消化后的组织块进行间充质干细胞培养，获得脐带间充质干细胞。本申请的制备方法，不使用胰酶，减少了细胞损伤；采用高浓度的胶原酶，并提高胶原酶处理温度，减少了消化处理时间；并且，为了避免浪费，本申请还对消化后的组织块进行间充质干细胞培养。总的来说，本申请的制备方法结合组织块贴壁培养法和酶消化法的优势，能够有效且可重复的分离MSC，有效提高了脐带MSC的分离效率以及细胞数量，为后期基础研究和临床应用提供了保障。

优选的，华通氏胶采用以下方法获得，取离体的脐带，在无菌条件下去除静脉和动脉，剥离脐带外膜，即获得华通氏胶。

优选的，胶原酶为II型胶原酶或IV型胶原酶。

优选的，胶原酶采用Hanks缓冲液制备。