[发明专利]寡核糖核苷酸的纯化方法及试剂盒

说明书

本发明涉及生物化学领域，更具体地，本发明涉及一种用于纯化寡核糖核苷酸(RNA)的方法。该方法可以简单高效地纯化多种寡核糖核苷酸，包括高通量合成的寡核糖核苷酸、寡核糖核苷酸的短序列和高U含量序列，同时保证较高的回收率。

技术领域

本发明涉及生物化学领域，更具体地，本发明涉及一种用于纯化寡核糖核苷酸(RNA)的方法。

背景技术

寡核苷酸通常由几十个核苷酸构成，是一类序列较短的单链核酸分子。寡合苷酸可作为引物、基因探针、合成基因基础片段、基因治疗相关药物等，广泛应用于现代分子生物学研究中。寡合苷酸的合成通常使用固相亚磷酰胺化学合成法，该方法现在仍被大多商业化DNA合成公司所采用。该合成方法是从3’端到5’端延长核苷酸链的循环过程，核苷酸链将从第一个被固定在载体表面的受保护的核苷酸分子开始延伸，其中，所述固定化载体可以是可控孔径玻璃微球(CPG)或聚苯乙烯微球(PS)，将试剂泵入并流经材质表面，诱导分步添加的核苷酸单体加入到寡核苷酸链上，使寡核苷酸链不断延长。每添加一个核苷酸单体到核苷酸链上都包括以下四个步骤：(1)脱保护：用三氯乙酸(TCA)或二氯乙酸(DCA)从延长的核苷酸链的5’端末端移除二甲氧三苯甲基(DMT)基团，并产生一个5’端活性羟基基团；(2)耦合：脱氧核苷亚磷酰胺分子在适当的活化剂(如四唑)作用下，会产生一个活性单体分子，与上一步产生的5’羟基基团进行反应；(3)盖帽：为了减少含有缺失碱基的产物，未耦合的5’羟基基团会被封闭，常用的封闭试剂是酰化试剂；(4)氧化：连接核苷酸分子之间的亚磷酯键是不稳定的，容易被酸、碱水解，所以需要被氧化成为更加稳定的磷酸三酯。不断重复进行上述四步反应，以将脱氧核苷单体分子不断加入到核苷酸链上。整个合成过程完成后，将寡核苷酸从固相上切除。

RNA和DNA的一级结构相似，但有两个重要区别：尿嘧啶取代胸腺嘧啶作为杂环碱基之一；RNA含有核糖而不是2’-脱氧核糖。因此，虽然RNA的固相合成是基于固相DNA合成的，但RNA呋喃核糖环的2’-位置上单一羟基的存在使得RNA的合成难度远远高于DNA。最常用的保护RNA合成的2’-OH的方法是叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)法。由于TBS基团的空间影响，RNA合成中亚磷酰胺偶联时间更长；而且2’-OH保护基团必须在整个固相合成循环中保留，然后在合成结束时干净地去除，并且在合成或脱保护过程中没有3’到2’磷酸盐迁移。

含有2’-O-TBDMS基团的寡核糖核苷酸脱保护包括2个步骤，首先需要类似于脱保护DNA的基本步骤，可以使用甲胺水溶液于65℃经1小时完成，从载体上切割寡聚体并将碱基和磷酸基团去除(US5804683)。该操作将RNA从固相载体上切割下来，且脱除磷酸上的氰乙基保护和碱基上胺基的保护。但是脱除的氰乙基具有高反应性，有可能重新加合到胸苷上产生杂质。第二步是从寡核糖核苷酸去除2’-O-TBDMS基团，采用三乙胺三氢氟化物作为脱硅烷基，N-甲基吡咯烷酮为溶剂，于65℃经30分钟-90分钟完成(US5831071)。专利CN101137662A描述了一种“一锅”脱保护法，采用三乙胺三氢氟化物在共溶剂(如DMSO)于65℃在60分钟完成，随后采用乙酸钠淬灭反应，通过Q-5PW等层析柱进行提纯。对于96通道或更高通量的RNA合成工作，要对每一个通道分别进行层析纯化，是费时费力且不现实的。

现有技术中，在从寡核糖核苷酸去除2’-O-TBDMS基团后，RNA的纯化技术中，部分技术采用层析纯化法进行除盐除杂提纯，该方法首先需要对层析柱进行清洗，然后将样品吸附在层析柱上，用缓冲液进行解析，收集特定组分，得到提纯后的RNA，该方法操作复杂，流程长，不适用于高通量合成的RNA。而部分技术采用叔丁醇沉淀法进行提纯，该方法通用性较差，对低于10nt长度的RNA和高U含量的RNA无产品沉淀，无法进行提纯。

因此，本领域亟需一种寡核糖核苷酸的纯化方法，该方法简单高效，适用于高通量合成的寡核糖核苷酸，同时还可以对寡核糖核苷酸的短序列和高U含量序列进行纯化。

发明内容