[发明专利]一种体外检测OGT酶活性的方法

权利要求书

1.一种体外检测OGT酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)OGT底物多肽的制备；

2)OGT底物多肽的偶联固定及非特异性位点的封闭；

3)加入含有待测样品的OGT酶样品反应体系，对OGT底物多肽进行糖基化修饰；

4)通过生物化学发光检测法检测糖基化的OGT底物多肽，所述生物化学发光检测法包括凝集素标记发光法、基于抗体标记发光法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述OGT底物多肽为ZO3-S371A，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述OGT底物多肽的制备包括OGT底物多肽的固相合成及纯化。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述OGT底物多肽的氨基末端含有具有固定作用的第一功能基团，所述OGT底物多肽通过所述第一功能基团与吸附有第二功能基团的载体材料反应，进行固定、封闭，

所述第一功能基团、第二功能基团为能够发生点击化学反应的成对基团，包括半胱氨酸与马来酰亚胺基团、氨基与活化脂、端基炔及叠氮，

所述载体材料包括96-孔板、磁珠、芯片；

当所述OGT底物多肽的氨基末端含有半胱氨酸时，所述OGT底物多肽通过半胱氨酸巯基与所述载体材料的马来酰亚胺基团反应，进行固定、封闭。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的OGT底物多肽的固定、封闭方法，包括以下步骤：

2.1)所述OGT底物多肽溶解于固定缓冲液，所述固定缓冲液含有0.05-0.50mM Na₃PO₄，0.05-0.5mM NaCl，1-100mM EDTA，pH 7.0-7.5，所述OGT底物多肽的浓度为10-100ug/ml；

2.2)与含有马来酰亚胺的载体材料进行孵育，时间0.5-4h，温度为4-37℃；

2.3)孵育后的载体材料用洗涤缓冲液漂洗；

2.4)加入5-50ug/ml的半胱氨酸缓冲液，对所述载体材料进行孵育封闭，时间0.5-2h，温度为4-37℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述OGT酶样品反应体系包括OGT酶反应缓冲液、OGT酶供体底物及OGT酶样品，

所述OGT酶反应缓冲液为1-100mM Tris-HCl，0.1-100mM DTT，10-125mM MgCl₂，

所述OGT酶供体底物为UDP-GlcNAc或与UDP-GlcNAc类似的人工修饰物，所述OGT酶供体底物的浓度为50-1000uM。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述糖基化修饰是指OGT酶样品与载体材料进行孵育，所述孵育的时间为1-12h，温度为12-37℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝集素标记发光法包括WGA-FITC荧光信号检测法或WGA-HRP酶促显色检测法；

所述WGA-FITC荧光信号检测法的检测限为5ug/ml，所述WGA-HRP酶促显色检测法的检测限为3.125ug/ml；

所述基于抗体标记发光法的的检测限为0.3125ug/ml。

9.根据权利要求1～8任一所述的方法在体外检测OGT酶活性中的应用。

10.一种体外检测OGT酶活性的装置，其特征在于，使用如权利要求1～8任一所述的方法，所述装置包括检测板、检测盒及试纸条。