[发明专利]一种体外检测OGT酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种体外检测OGT酶活性的方法，即体外检测O‑连接‑N‑乙酰氨基葡萄糖基转移酶OGT的酶活性的方法，该方法构建成本低，操作简单，检测灵敏度高。本发明公布的方法包括步骤：1)OGT高活性底物多肽ZO3‑S371A的合成及纯化；2)OGT底物多肽ZO3‑S371A的偶联固定及非特异性位点的封闭；3)OGT对底物多肽的糖基化修饰4)通过WGA‑FITC或WGA‑HRP检测OGT糖基化的底物多肽。本发明所述的方法，底物多肽的活性高，制备成本低，检测操作简单，灵敏度高，可用于体外测定表达纯化的OGT及病理组织来源样品中OGT的酶活性，也可以用于评价OGT抑制剂药物的活性。

技术领域

本发明属于生物化学分析检测技术领域，具体涉及一种体外检测OGT酶活 性的方法，即一种O-连接-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶OGT的酶活性的检测方 法。

背景技术

O-连接-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶OGT负责催化真核细胞内蛋白质丝氨 酸和苏氨酸侧链羟基的O连N-乙酰-葡糖胺修饰，简称为O-GlcNAc糖基化修饰。 人体内能够被OGT酶介导O-GlcNAc糖基化修饰的底物蛋白质数量多，且涉及 人体细胞活动和生物反应的多个层面，参与调控涉及STAT3、p53等重要转录因 子介导的基因表达、调控组蛋白和细胞周期蛋白等介导的细胞周期、通过直接或 者间接的细胞内底物蛋白质修饰控制细胞内关键蛋白或酶的生物活性而影响细 胞内信号通路的转导和活性，最终影响人体的基本生理功能和病理变化反应。人 体体内正常水平的O-GlcNAc糖基化修饰支持细胞生理活动的正常调控，而异常 体内异常的O-GlcNAc糖基化修饰水平与多种肿瘤的发生发展有着紧密联系。肿 瘤病理组织样本研究已经证明，在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、 胰腺癌、膀胱癌等肿瘤细胞中都呈现有过度的OGT酶活性及其介导的高度 O-GlcNAc糖基化修饰。因此，OGT酶活性的检测及其抑制剂的发现是开发其相 关肿瘤诊断方法和药物的关键。

目前市场在售的OGT酶活性检测试剂盒非常有限，其中一款为基于生物冷 发光的UDP-Glo检测方法，其是通过对OGT酶反应副产物UDP的间接检测， 容易受到样品中UDP的干扰，且其生产成本和销售价格较高。学术研究中常用 的OGT酶活性检测方法有液相色谱法、质谱法、荧光偏振法、点击化学法等。 液相方法是对OGT糖基化底物极性改变的检测，质谱法是对OGT糖基化底物 分子量改变的检测，两种方法对样品的前处理要求较高，很容易受到样品中其他 物质的干扰。荧光偏振法中涉及到对供体底物或受体底物的修饰，不能体现OGT 的天然酶活性，且荧光底物合成较为繁琐。点击化学方法中利用非天然的OGT 酶供体底物如叠氮功能化修饰的UDP-GlcNAz，随后采用炔基功能的信号分子与 其发生点击化学反应来检测OGT酶活性的方法，但该法涉及的化学合成步骤繁 琐，其中叠氮的合成过程中存在安全隐患，同时生产成本较高，并且非天然的供 体底物不具有与天然底物同样的活性。此外，也有报道以同位素标记的供体底物 来检测OGT对底物蛋白质的活性，但其具有潜在的放射性危害，对环境不友好， 对设备环境等要求很高，难以推广使用。

发明内容

发明目的：为了克服现有OGT酶活性检测技术中存在的缺陷和技术瓶颈， 并提高OGT酶活检测技术的灵敏度和准确度，本发明提供了一种体外检测OGT 酶活性的方法，即一种基于OGT酶天然高活性底物多肽和生物化学发光原理的 OGT酶活性检测方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明是一种简单且高灵敏度的OGT酶活性的检测新技术。首先，设计并 通过多肽固相合成方法制备天然的高活性OGT底物多肽ZO3-S371A，氨基酸序 列如SEQ ID No.2所示；然后，将OGT底物多肽酶ZO3-S371A通过其氨基末端 的半胱氨酸固定于含有马来酰亚胺的96孔酶标板；然后，在96孔板中加入半胱 氨酸封闭液封闭96孔板未反应的马来酰亚胺基团；最后利用辣根过氧化物酶标 记的麦芽凝集素WGA-HRP或荧光标记的麦芽凝集素WGA-FITC对含有 O-GlcNAc修饰的多肽进行标记，并进行随后的发光检测读取OGT酶活性。