[发明专利]慢病毒载体、系统及其应用

说明书

本发明公开了一种慢病毒载体，具有截短的顺式作用元件，以SEQ ID NO:1所示的顺式作用元件为基准，所述截短的顺式作用元件具有在如下位置处的缺失：第541位至第690位中的任意一个或多个碱基。本发明还公开了基于该慢病毒载体的慢病毒载体系统、宿主细胞、应用及转染方法。

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，具体涉及一种慢病毒载体、系统及其应用。

背景技术

慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的病毒载体。慢病毒载体可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，此外区别于来自小鼠白血病病毒的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达；同时与逆转录病毒可能因为整合而引起肿瘤不同，目前的多方面临床研究证实了慢病毒载体的安全性，因此慢病毒载体具有广阔的发展前景。

慢病毒属于逆转录病毒科，但其基因组结构复杂，除gag、pol和env这3个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外，还包括4个辅助基因，vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。HIV-1是慢病毒中最具特征性的病毒，第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV)的可能性，第三代载体将包装成分的5’LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子获得RSV启动子，3’LTR进行缺失突变,并添加SV 40polyA位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上，即一个表达gag和pol、另一个表达env。根据这个原理构建了三质粒表达系统。三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和穿梭质粒。其中包装质粒在CMV启动子的控制下，表达HIV-1复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)，应用VSV-G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；穿梭质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留了RRE，cPPT/CTS等序列(见图1)，并在其中插入目的基因(GOI,gene of interest)。

无论哪一种慢病毒载体，都必须保留5’端R，U5，包装信号(PSI),RRE和cPPT/CTS等顺式作用元件，这些元件是慢病毒基因组包装进病毒颗粒所必需的。目前这部分序列在通用的慢病毒载体上长度约为1720bp,其中包括了5’端LTR(R+U5区)序列199bp，PSI序列491bp，RRE序列858bp，cPPT/CTS序列147bp，其它用于连接的序列(主要是酶切位点)25bp。

慢病毒载体包装出毒的效率是和插入的外源基因长度负相关的，插入的序列越长，得到的慢病毒滴度就越低。例如在科研中最常使用的spCas9就属于大基因，其长度在4.2kb以上，对于这类基因使用慢病毒载体就受到了慢病毒载体容量的限制，融合EGFP荧光等标记以后长度进一步加长，更是严重影响了病毒出毒效率。为此，增加慢病毒载体的容量意义重大。

发明内容

基于此，有必要针对慢病毒载体容量小的问题，提供一种慢病毒载体、系统及其应用。

本发明的第一目的在于提供一种慢病毒载体，具有截短的顺式作用元件，以SEQID NO:1所示的顺式作用元件为基准，所述截短的顺式作用元件具有在如下位置处的缺失：

第541位至第690位中的任意一个或多个碱基。

在其中一些实施例中，还具有如下一种或多种位置处的缺失：