[发明专利]一种内质网膜融合脂质体及其制备方法和应用

权利要求书

1. 一种内质网膜融合脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤如下：

（1）内质网膜的提取

准备T75培养瓶的B16F10或者DC2.4细胞，计数3*10⁷-7*10⁷，用PBS缓冲液洗涤两次后，使用胰蛋白酶乙二胺四乙酸盐酸盐消化1-4min，加入完全培养基终止消化 ，收集细胞消化液离心5-10min；弃上清，保留细胞沉淀；加入预冷的研磨缓冲液和蛋白酶抑制剂，转移到预冷的DOUNCE匀浆器中，冰上匀浆20-50下，直到显微镜下观察大部分细胞裂解；将匀浆物转移到离心管中，4℃离心1000g去除细胞核和细胞碎片，收集上清液；然后将上清液4℃、12000g离心15-40min，收集上清液；使用超速离心机和配套管在4℃、100000g-200000g条件下再次离心 60-120min，抽取上清液，沉淀颗粒即为粗提的内质网成分；

（2）脂质体的制备和表征

通过薄膜水化法、反复冻融法、硫酸铵梯度法或者微流控制备脂质体；

针对脂溶性药物，选用薄膜水化法制备脂质体，具体为：

制备脂质体，将含有摩尔比为（1-4）：（0.5-1.5）：（0.15-0.65）：（0.5-1.5）的DOTAP，DOPE，DSPE-PEG，CHOL和占总磷脂质量为5%-15%之间的脂溶性药物溶解于氯仿，在70-100rpm，20-40℃条件下真空旋蒸后形成脂质薄膜，然后在冰浴中20%-25%功率探头超声1-5s，30-50℃下600-1000rpm 与PBS水合，搅拌30-120min；在30-50℃恒温条件下用220nm的聚碳酸酯膜过滤器强制挤出得到脂质体溶液；

针对水溶性药物，可以选用硫酸铵梯度法和反复冻融法来包载药物制备脂质体；

针对mRNA，可以采用微流控法；

（3）内质网膜融合脂质体的制备和表征

脂质体与内质网膜融合的方法包括但不限于超声融合、反复多次冻融、脂质挤压的方法；

所述脂质体与内质网膜超声融合，具体方法为：

将脂质体滴入内质网溶液中，Lip与EM中蛋白的浓度比为（1-10）：（1-2），然后在30-50℃超声混合1-5分钟，室温磁力搅拌15-60min，然后使用脂质体挤出机通过400nm或者200nm聚碳酸酯膜连续挤出。

2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中准备T75培养瓶的细胞，计数5*10⁷，用PBS缓冲液洗涤两次后，使用胰蛋白酶乙二胺四乙酸盐酸盐消化2min，加入DMEM完全培养基终止消化 ，收集细胞消化液离心5min；弃上清，保留细胞沉淀；加入预冷的研磨缓冲液和蛋白酶抑制剂，转移到预冷的DOUNCE匀浆器中，冰上匀浆50下，直到显微镜下观察大部分细胞裂解；将匀浆物转移到离心管中，4℃离心1000g去除细胞核和细胞碎片，收集上清液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中将上清液4℃、12000g离心25min，收集上清液；使用超速离心机和配套管在4℃、100000g条件下再次离心60min，抽取上清液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中制备脂质体，将含有摩尔比为3：1：0.27：1的DOTAP，DOPE，DSPE-PEG，CHOL溶解于氯仿，80rpm，40℃真空旋蒸后形成脂质薄膜。

5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中然后在冰浴中25%功率探头超声2s，40℃下800rpm与 PBS水合，搅拌60min；在40℃恒温条件下用220nm的聚碳酸酯膜过滤器强制挤出得到脂质体溶液。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中将脂质体滴入内质网溶液中，Lip与EM中蛋白的浓度比为2：1，然后在40℃超声混合2min，室温磁力搅拌30min。

7.如权利要求1-6任一项所述制备方法获得的内质网膜融合脂质体。