[发明专利]一种内质网膜融合脂质体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种内质网膜融合脂质体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。步骤为：（1）内质网膜的提取；（2）脂质体的制备和表征；（3）内质网膜融合脂质体的制备和表征。本发明使用薄膜分散法制备的脂质体粒径控制在103.03±7.99nm，粒径分布窄，PDI=0.149±0.02，zeta电位为41.8±2.71mV。与内质网膜融合后，最终的内质网膜融合脂质体（EM/Lip）粒径控制在124.27±4.21nm，PDI=0.19±0.03，zeta电位为14.27±2.50mV。本发明中EM/Lip进入细胞后大部分定位于内质网，极少进入溶酶体，从而避免药物在溶酶体的降解，实现了内质网的靶向功能。本发明获得的内质网膜融合脂质体可以在免疫细胞和肿瘤细胞的内质网靶向功能，激光共聚焦的三维图像技术也良好应用于亚细胞器水平纳米制剂分布的研究。

技术领域

本发明涉及一种内质网膜融合脂质体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

随着精准医学的发展，基于疾病本身发生发展的关键生物大分子，如基因和蛋白质等来开发合适的药物以及药物递送系统成为最新研究热点。并且大多数的与疾病相关关键生物分子是位于细胞内的。只有精准的靶向才能实现精准的生命调控，提高药物治疗指数的一种有吸引力的策略是：不但要携带治疗剂到达靶组织、靶细胞，而且还要控制药物精准靶向亚细胞结构，实现细胞内靶点的精准药物分布和释放。然而，迄今为止对于大多数药物递送系统的研究都在努力克服的长循环、跨血管、肿瘤微环境等细胞外屏障，以靶向细胞而结束。但不可避免地，药物要想发挥作用必然会在细胞内亚细胞水平上经历重重障碍，例如细胞器膜的阻碍、内体包埋和溶酶体降解等。在实现疾病区域靶向聚集后，利用纳米制剂绕过其他细胞器壁垒，将活性形式的药物输送到目标亚细胞结构，使其集中在分子作用靶点附近释放，从而改变药物细胞内分布动力学，成为实现精准靶向药物递送的新兴有前途的策略。这一策略可以有效增加药物作用靶标处的药物浓度，提高最终靶标的传递效率，具有提高疗效、降低毒副作用、克服多药耐药性的优点。

在过去几年中，针对包括细胞核，线粒体，溶酶体，和内质网等在内的不同细胞器的靶向策略取得了进展。其中，最有潜力的当属内质网靶向纳米递送系统。这是因为作为细胞内最大的亚细胞结构，内质网控制着蛋白质等生物大分子合成、折叠、转运及细胞内的动态钙稳态和脂质生物合成，在细胞存活和稳态中起着重要作用。在像肿瘤细胞一样代谢速率较快的疾病模型中，内质网中蛋白质折叠和组装的速率常常增加，削弱其功能，影响蛋白质折叠应答已成为一种新型的下一代抗癌策略。同时内质网中呈弱碱性，含有大量的钙离子，当受到应激时，内质网将释放出钙离子，并启动caspase-8相关的细胞调亡程序，而内质网应激是许多包括癌症在内的疾病的共同特征，持续或严重的内质网应激可直接导致细胞死亡，这为疾病的治疗干预提供了一种新的有希望的策略。

另外需要指出的是，众多的纳米制剂或者药物内吞进入细胞主要依靠网格蛋白介导或者小窝蛋白介导的两种内吞作用。其中，网格蛋白介导的内吞作用是纳米制剂进入细胞最常见作用机制，纳米制剂被网格蛋白介导内吞后，吞噬体囊泡通常会与初级内体特异性融合，然后这些囊泡转化为次级内体，最终进入溶酶体，在溶酶体内纳米制剂会被各种水解酶破坏。而小窝蛋白介导的小窝体通常不会与溶酶体融合，直接转移到内质网或者高尔基体与内质网以及高尔基复合体融合，从而可以避免被溶酶体的降解。因此在实现内质网靶向过程中，纳米制剂被希望更多通过小窝蛋白介导的内吞途径携带药物进入细胞，从而避免药物在溶酶体的降解。这一需求在mRNA疫苗和多肽抗原的细胞内递送过程中更为迫切。mRNA疫苗中的mRNA需要卸载在细胞质中，在内质网和核糖体上进行翻译和蛋白质处理以进行MHC呈递。因此，实现内质网靶向十分有必要。

目前对于内质网靶向纳米制剂的研究，主要依赖于内质网靶向分子的发现和探寻。如KKXX多肽、疏水性嵌段环氧丙烷、内质网靶向光敏剂TCPP-TER等。但这些靶向分子的发现和设计依赖于位于内质网上的靶标蛋白的全方位解析，探索成本过高；精心设计的合成材料由于其不确定的生物相容性和复杂的化学反应不利于临床转化。天然存在的生物材料如细胞、外泌体、细胞器等引起了充分的关注，可以作为新的候选物来丰富生物材料库以用于准确的疾病治疗。

发明内容