[发明专利]一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法

说明书

本发明公开了一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法，包含以下组分：0.2％～0.3％(w/v)蔗糖，0.1％～0.4％(w/v)海藻糖，0.2％～0.5％(w/v)D‑甘露醇，0.1％～0.4％(w/v)甘氨酸，0.02％～0.05％(v/v)吐温20，5mM～10mM Mgsupgt;2+/supgt;。本发明通过配方筛选和优化，所得到的鞘磷脂酶冻干粉具有酶活力高、热稳定性好、储存时间长、外观良好的特性。

技术领域

本发明一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

鞘磷脂(Sphingomyslin,SM)存在于大多数哺乳动物细胞的质膜内，是细胞膜上的一类磷脂，是构成脂筏的重要组成部分。鞘磷脂酶(Sphingomyelinase,SPC)是鞘磷脂代谢途径中一类十分重要的水解酶，鞘磷脂在其水解作用下产生神经酰胺，所以鞘磷脂酶也被认为是控制神经酰胺合成的关键酶之一。

小而密低密度脂蛋白(small dense Low-Density Lipoprotein,sdLDL)是低密度脂蛋白(Low-Density Lipoprotein,LDL)中颗粒较小密度较大的亚组分，具有较强的致动脉粥样硬化作用，同时也是导致冠心病的重要危险因素。目前临床上检测sdLDL运用最广泛的方法是利用酶法生化诊断试剂，鞘磷脂酶是该类诊断试剂的核心原料，对鞘磷脂酶的制备方法和长期储存稳定性的研究具有重要意义。

酶制剂在保存时会受到环境因素的影响，温度或高或温差过大都会使酶制剂产生失活的现象。目前常用的酶制剂保存方法通常包括：1、低温保存，低温保存能够保持酶的性能在一定时期内相对稳定，但若要进行半年以上长时间的保存需要置于-70℃并经过专业的密封程序；2、结晶保存，结晶保存的酶可在长时间内保持稳定性，但结晶过程需要严格控制含水量，否则易带来微生物污染等问题；3、加入保护剂冻干保存，保护剂能够使酶的稳定性更加优越，但冻干保护剂的选择也直接影响了冻干酶制剂的储存稳定性。由于冻干过程是一个复杂的相变过程，鞘磷脂酶作为一种蛋白质，在冷冻干燥过程中极易受到冻干过程的低温效应、冻结效应和脱水效应的影响，最终导致其酶活性的降低甚至失活。因此为了减少鞘磷脂酶活性在冻干过程中的损伤，筛选合适的冻干保护剂尤为重要。

申请人检索的背景文献情况如下：

公开号为CN109837270A的专利文献中公开了一种使鞘磷脂酶在液体中长期稳定的方法，该专利提供了一种能够提高鞘磷脂酶在液体中稳定性的配方，其制备鞘磷脂酶采用的储存方法是液体试剂，而非冻干粉末。阿拉丁CAS号为9031-54-3的鞘磷脂酶为液体制剂为保存于50％甘油/0.25M磷酸盐缓冲液中的液体制剂。与之类似的，sigma货号为9031-54-3的鞘磷脂酶浓度约100units/mg，且同样需要在50％甘油-250mM磷酸盐缓冲液的保护下，于2～8℃保存。

除此之外，现有技术中暂未搜索到鞘磷脂酶关于冷冻干燥制备的相关文献及方法。冻干粉有着便于产品运输、储存时占地面积小等液体酶制剂不具备的优点，因此随着鞘磷脂酶的需求量日益增大，研究开发出一种配方简单、成本低廉、稳定有效的鞘磷脂酶冻干保护剂配方尤为重要。

发明内容

本发明提供了一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法，通过配方筛选和优化，所得到的鞘磷脂酶冻干粉具有酶活力高、热稳定性好、储存时间长、外观良好的特性。

本发明提供了鞘磷脂酶的冻干保护剂，包含按质量计的如下组分：蔗糖2～3份，海藻糖1～4份，D-甘露糖2～5份，甘氨酸1～4份，吐温20 0.2～0.5份和适量提供Mg²⁺的镁盐。

在一种实施方式中，所述冻干保护剂包含以下组分蔗糖2～3g/L，海藻糖1～4g/L，D-甘露醇2～5g/L，甘氨酸1～4g/L，吐温20 0.02％～0.05％(v/v)，Mg²⁺5mM～10mM。