[发明专利]一种提高乌菜小孢子出胚率的方法

说明书

本发明涉及植物组织培养技术领域，提供了一种提高乌菜小孢子出胚率的方法，在乌菜花蕾采摘24h前，在乌菜植株的花蕾上喷施0.05～0.2mg/L芸薹素内酯BR；同时，在乌菜花蕾采摘后的小孢子培养阶段，在小孢子培养基中添加100～300mg/L聚乙烯吡咯烷酮PVP。本发明的优点在于：本发明研发了一种喷施芸薹素内酯在乌菜植株上，同时添加一种非离子型高分子化合物PVP用以提高乌菜小孢子出胚率的方法，该方法不仅可以显著地提高乌菜出胚率，而且更容易建立乌菜小孢子培养体系，加快乌菜单倍体育种研究。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种提高乌菜小孢子出胚率的方法。

背景技术

乌菜(Brassica campestris L.ssp.Chinensis)是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种，两年生蔬菜，营养丰富，经济价值高，主要以叶片为食。目前，乌菜在全国大部分地区都有种植，其中，南方有很多种植区，特别是安徽、上海、江苏等地，种植面积很大。安徽乌菜是安徽省著名特产之一，具有分布广、产量高、风味好、供货期长等优点。

小孢子时期是高等植物生活史中雄配子体发育过程中短暂而重要的阶段,小孢子是减数分裂后四分体释放出的单核细胞，即发育至一定阶段的未成熟的花粉。游离小孢子培养基于植物细胞全能性原理，将植物的小孢子在特定条件下进行组织培养，从而获得再生植株。游离小孢子培养技术是一种单倍体育种技术，是将处于一定发育时期的小孢子从花药分离出来，在无菌条件下通过一定处理，使其发育成为完整可育的植株的过程。在乌菜小孢子培养过程中，因为基因型导致的乌菜出胚率低的情况普遍，改变这一情况迫在眉睫。

目前，芸薹属小孢子培养过程中主要是通过在NLN培养基中添加不同添加剂来优化小孢子培养体系，其中，添加活性炭、硝酸银等较为普遍，但对乌菜小孢子培养效果不显著。不同植物激素如IAA、6-BA添加在培养基中对芸薹属小孢子培养也有不同程度的影响，但很难找到一种具有显著效果的体系或方法去提高乌菜小孢子出胚率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有显著效果的提高乌菜小孢子出胚率的方法。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种提高乌菜小孢子出胚率的方法，在乌菜花蕾采摘24h前，在乌菜植株的花蕾上喷施0.05～0.2mg/L芸薹素内酯BR；同时，在乌菜花蕾采摘后的小孢子培养阶段，在小孢子培养基中添加100～300mg/L聚乙烯吡咯烷酮PVP。

作为本发明的优选方式之一，包括如下具体步骤：

(1)于抽薹开花期，在乌菜植株的花蕾上喷施0.05～0.2mg/L芸薹素内酯BR，并在喷施处理24h后采摘相应的花蕾样本，用于后续小孢子培养；

(2)将采摘的花蕾样本置于4℃环境下预冷处理1d；

(3)预冷处理后，挑选单核靠边期的花蕾样本，并先后采用70％酒精消毒30s、0.1％的HgCI摇晃消毒6min，最后再采用无菌水冲洗3次，每次5min；接着，在玻璃杯中加入B5培养基，并用玻璃棒研碎花蕾以释放出小孢子；然后，用钢丝网筛将玻璃杯中的小孢子溶液过滤到新的灭菌玻璃杯中，再用细胞网筛二次过滤到离心管，离心处理；最后，用B5培养基重悬离心沉淀，并再次离心，最终获得的沉淀即为目标所需的纯化小孢子；

(4)用NLN培养基重悬步骤(3)得到的纯化小孢子，并在其中添加浓度为100～300mg/L的聚乙烯吡咯烷酮PVP；

(5)将步骤(4)的培养物于33℃温度下热激处理24h后转至25℃下黑暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，将其置于摇床上25℃振荡培养。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，芸薹素内酯的喷施浓度具体为0.1mg/L。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，钢丝网筛为300目，细胞网筛为40um。