[发明专利]烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法

权利要求书

1.烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：烟草无菌苗获得和培养

选用健康饱满的烟草种子，用酒精和次氯酸钠对烟草种子表面各消毒3min，并用无菌水清洗三遍，用无菌滤纸吸干烟草种子表面的无菌水后，将烟草种子置于灭菌的MS培养基上培养，培育温度为22-30℃，获得烟草无菌苗；

S2：烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的发酵培养

将纯化培养得到的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌接种于常规PDA培养基上活化培养18-36h，从常规PDA培养基上挑取一环单菌落接入NB液体培养基中，于30℃、180转/分钟条件下振荡培养24-72h，获得旺盛生长的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌培养物；

S3：茄科雷尔氏菌接种和发病植株的保存

选择4-8叶期的烟草无菌苗，采用针刺灌根法对步骤S1中获得的烟草无菌苗接种经步骤S2发酵培养获得的茄科雷尔氏菌发酵液，接种后培养烟草无菌苗，选择具备典型烟草青枯病发病症状的烟草植株，将该烟草植株置于35-41℃条件下充分光照培养4-5天，待烟草青枯病发病症状稳定或不再发展时，将该烟草植株转入22-28℃温度条件下继续在组培瓶中培养并保存；

S4：茄科雷尔氏菌的再培养与纯化

在无菌条件下从步骤S3中保存的具有烟草青枯病发病症状的烟草植株中分离茄科雷尔氏菌，具体方法如下：切取步骤S3中保存的具有烟草青枯病发病症状的烟草植株茎段2-3cm，将茎段放入研钵中，加入无菌水，研磨出组织液，再用接种环蘸取组织液在PDA培养基上划线接种，然后将PDA培养基置于25-30℃恒温培养箱中培养12-48h，之后挑取一环单菌落菌株，利用平板划线法在新的PDA或NA固体培养基中培养，传代培养三代，至菌落形态稳定即得。

2.根据权利要求1所述的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，步骤S2中NB液体培养基的振荡培养时间为36-48h。

3.根据权利要求1所述的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，步骤S3中的针刺灌根法的具体操作如下：用灭菌的细针从烟草底部第三叶的叶腋垂直刺入茎部，刺出伤口，在伤口处注入0.1-1ml步骤S2中的茄科雷尔氏菌发酵液，或直接用步骤S2中的茄科雷尔氏菌发酵液灌根；接种后置于22-30℃的光照培养箱中培养，每天观察烟草苗病情情况。

4.根据权利要求3所述的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，接种后的培养温度为22-28℃。

5.根据权利要求1所述的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，步骤S4中PDA培养基的培养时间为20-26h。

6.根据权利要求1所述的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，其特征在于，步骤S3中发病植株的保存方法还可通过盆栽方法移栽发病植株来实现；但是，在开放式培养条件下培养的带病原菌植株，进行病原菌再分离时需要取病健交界部位表面除菌或进行组织分离，才能重新获得烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌。