[发明专利]烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法

说明书

本发明涉及农业生物技术领域，公开了烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的保存方法，包括烟草无菌苗获得和培养、烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的发酵培养、茄科雷尔氏菌接种和发病植株的保存以及茄科雷尔氏菌的再培养与纯化。本发明的制备和保存方法简便易行，在本发明的保存条件下可保存60‑120天，且在此期限内茄科雷尔氏菌的侵染效率和致病性与自然茄科雷尔氏菌相同，在需要时及时培养可获得高致病性的茄科雷尔氏菌培养物；本发明通过寄主活体培养和高温处理，保证了带菌植物的生长，同时也使得菌株的致病性性状稳定，目标菌纯度有保证。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法。

背景技术

烟草青枯病又称黏液病、烟瘟、半边疯，主要是由茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种细菌性病害，该病害普遍发生在我国长江流域及西南烟区，危害严重，常造成烟叶产量和品质降低甚至绝收。目前，在生产中主要采用化学农药防治茄科雷尔氏菌，但是该方法并不能有效地防止该病发生；茄科雷尔氏菌导致烟草发病后更不能实现有效治疗，且长期大量施用化学农药既容易使病菌产生抗药性，又容易造成环境污染。目前生物防治具有可预防、无污染和长效性等优点，在植物病害的防治中具有越来越重要的位置，而开展有效的生物防治需要研究病原菌的致病性和病原菌与拮抗菌的互作关系，这就需要稳定且大量的病原菌。专利号为CN102229897B题目为一种导致烟草青枯病的茄科雷尔氏菌高纯培养物制备和保存方法的专利主要是利用目标菌的寄主植物——烟草，其茎秆微管系统发达的特性，直接将具有烟草青枯病典型症状的病株茎秆进行保湿培养，从而获得高纯培养物。贵州农业科学刊登的名为烟草青枯病菌种保存方法及其对致病力的影响的文献为在烟草青枯病的防治和烟草抗病性鉴定研究中获得致病力较强的菌株，分别采用烟草组培苗活体保存、灭菌蒸馏水常温保存以及料面冰箱保存3种不同方法保存烟草青枯病菌，并比较了3种保存方法对烟草青枯病菌致病力的影响，结果表明：烟草组培苗活体保存法和灭菌蒸馏水常温保存法均具有较好的保持青枯病菌致病力活性的能力，前者比后者稍强，如需提取粗毒素，则建议使用后者,斜面冰箱保存法的致病力下降最快。

烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌在常规培养过程中，往往容易出现继代培养过程中病原菌致病性丧失问题，导致致病性实验和拮抗试验无法进行。因此为了防止茄科雷尔氏菌在人工培养基上连续传代出现致病力迅速下降或其它遗传性状改变的问题，避免现有茄科雷尔氏菌菌株保存培养方法的效果不确定的缺陷，急需发展一种经济有效的、并保持烟草青枯病致病菌固有特性的方法。

发明内容

基于以上问题，本发明提供烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，本发明的制备和保存方法简便易行，通过寄主活体培养和高温处理，保证了带菌植物的生长，同时也使得菌株的致病性性状稳定，目标菌纯度有保证。

为解决以上技术问题，本发明提供了烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的保存方法，包括以下步骤：

S1：烟草无菌苗获得和培养

选用健康饱满的烟草种子，用酒精和次氯酸钠对烟草种子表面各消毒3min，并用无菌水清洗三遍，用无菌滤纸吸干烟草种子表面的无菌水后，将烟草种子置于灭菌的MS培养基上培养，培育温度为22-30℃，获得烟草无菌苗；

S2：烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌的发酵培养

将纯化培养得到的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌接种于常规PDA培养基上活化培养18-36h，从常规PDA培养基上挑取一环单菌落接入NB液体培养基中，于30℃、180转/分钟条件下振荡培养24-72h，获得旺盛生长的烟草青枯病致病菌茄科雷尔氏菌培养物；

S3：茄科雷尔氏菌接种和发病植株的保存