[发明专利]表达非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的重组腺病毒及构建方法

权利要求书

1.一种表达非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的重组腺病毒载体，其特征在于，以pAD-CMV-3×FLAG腺病毒载体为基础，引入EP153R基因以构建重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R；所述EP153R基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述的表达非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成EP153R基因，并在EP153R基因的起始密码子前添加CACC四个碱基；

(2)将步骤(1)得到的EP153R基因和pENTRE-EGFP-TOPO载体进行TOPO克隆，得到pENTR-EGFP-ASFV-EP153R；

(3)将步骤(2)得到的pENTR-EGFP-ASFV-EP153R通过LR重组反应于腺病毒骨架载体pAD-CMV-3×FLAG进行重组，得到重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R。

3.一种重组腺病毒包装方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R用PacⅠ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染；转染293t细胞，实现重组腺病毒包装。

4.根据权利要求3所述的重组腺病毒包装方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染AD293细胞；

(2)转染后至细胞脱落、变圆且间隙变大时，收集细胞及上清，即为P1代重组腺病毒；

(3)P1代重组腺病毒感染293t细胞，观察细胞状态。

5.根据权利要求4所述的重组腺病毒包装方法，其特征在于，所述转染AD293细胞采用的转染试剂为ietPRIME kit转染试剂。

6.根据权利要求4所述的重组腺病毒包装方法，其特征在于，在步骤(2)中，收集细胞及上清后，置于-80℃反复冻融3次，12000×g离心10min，收集上清。

7.权利要求3-6所述的重组腺病毒包装方法制备得到的重组腺病毒。

8.包含权利要求7所述的重组腺病毒的疫苗。