[发明专利]表达非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的重组腺病毒及构建方法

说明书

本发明公开了一种表达非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的重组腺病毒及构建方法，属于基因工程技术领域，本发明利用重组腺病毒穿梭载体pENTRE‑EGFP‑TOPO，经过一系列中间过程，得到重组腺病毒载体pAD‑CMV‑EGFP‑EP153R；将其线性化后转染AD293细胞，根据腺病毒感染形成的细胞病变筛选重组病毒，实现腺病毒包装过程，获得表达非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的重组腺病毒，为构建表达非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的重组腺病毒疫苗奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种表达非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的重组腺病毒及构建方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病。临床表现为发热、皮肤发绀、淋巴结、肾、胃肠黏膜明显出血等。

非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是目前唯一的DNA虫媒病毒，通常认为只有一个血清型，国际上根据ASFV B646L基因末端一段478bp的核酸序列，将ASFV分为24个基因型，我国多属于基因Ⅱ型。非洲猪瘟病毒可通过家猪、野猪和软蜱进行传播，主要攻击猪单核、巨噬细胞。病毒粒子直径为175-215纳米，呈20面体对称，有囊膜，结构由内到外分别是类壳、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170-193kb，有150-167个开放阅读框，编码50多种结构蛋白和100多种非结构蛋白。参与病毒粒子结构构成的主要物质包括结构蛋白、基因转录和RNA修饰酶类。作为病毒粒子的主要成分，结构蛋白在ASFV吸附、侵入和复制等感染过程中起着重要作用。编码的蛋白主要有p72、p49、p30、p54、EP153R、CD2v等。EP153R蛋白由位于ASFV EcoRI E9基因组片段的EP153R基因编码，大小约为18kDa，在病毒感染的早期和晚期均发生转录。将标记基因LacZ插入到EP153R中，虽不改变体外病毒生长速度以及病毒的敏感性、耐药性，但消除了ASFV感染细胞诱导的血吸附现象。EP153R会稳固EP402R与其他配体间的相互作用，并且参与调解细胞的凋亡。目前还没有针对EP153R的重组腺病毒以及制备该重组腺病毒的可行方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的重组腺病毒及构建方法，以解决上述现有技术存在的问题，为研究非洲猪瘟候选疫苗奠定技术基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种表达非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的重组腺病毒载体，以pAD-CMV-3×FLAG腺病毒载体为基础，引入EP153R基因以构建重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R；所述EP153R基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种上述的表达非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)合成EP153R基因，并在EP153R基因的起始密码子前添加CACC四个碱基；

(2)将步骤(1)得到的EP153R基因和pENTRE-EGFP-TOPO载体进行TOPO克隆，得到pENTR-EGFP-ASFV-EP153R；

(3)将步骤(2)得到的pENTR-EGFP-ASFV-EP153R通过LR重组反应于腺病毒骨架载体pAD-CMV-3×FLAG进行重组，得到重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R。

本发明还提供一种重组腺病毒包装方法，将上述的重组腺病毒载体pAD-CMV-EGFP-EP153R用PacⅠ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染；转染293t细胞，实现重组腺病毒包装。

进一步地，包括以下步骤：