[发明专利]一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法在审

专利信息
申请号: 202111426433.X 申请日: 2021-11-27
公开(公告)号: CN116183732A 公开(公告)日: 2023-05-30
发明(设计)人: 黄正辉;孙笑非;罗宇航 申请(专利权)人: 中科南京生命健康高等研究院
主分类号: G01N30/02 分类号: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/12;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/72;G01N30/86
代理公司: 南京司南专利代理事务所(普通合伙) 32431 代理人: 于淼
地址: 211135 江苏省南京市江宁*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 一种 单克隆抗体 药物 动力学 谱分析 方法
【权利要求书】:

1.一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法,其特征在于,包括如下具体步骤:

S1、以生物靶向药物作为待分析的单克隆抗体药物,并定量称取,将其配制成原料药溶液;

S2、使用溶剂将原料药溶液分别稀释成不同浓度梯度的药液,并将该不同浓度的溶液作为系列标准溶液,以原料药溶液的总浓度作为标示量,计量各标准溶液中各组分的相对浓度;

S3、以灌胃或静脉注射的方式将步骤S2中制备的系列标准溶液给予健康受试动物,并分别收集动物血液样品于聚乙烯管中,分离血浆,得到血浆样品,使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液;

S4、向各血浆溶液中分别加入pH为5.0-9.0,浓度为5-500mmol/L的HEPES缓冲液,涡流混匀,在40-60℃条件下孵育50-80min,得到反应前溶液;

S5、向上述得到的反应前溶液中分别加入二甲基标记试剂1,在10-30℃条件下反应10-50min;

S6、向步骤S4处理后的溶液中加入含有变性剂的pH缓冲液,涡流混匀;再加入还原剂,涡流混匀;在60℃条件下孵育60-70min,得到反应液,然后再分别向体系中加入二甲基标记试剂2,在30-60℃条件下反应80-200min;最后加入100-1000mmol/L的NH4HCO3,终止标记反应;

S7、将步骤S6得到的溶液加入Glu-C对蛋白质进行酶解处理,蛋白质与酶的比例保持在1:25-100之间,酶解温度控制20-37℃,酶解时间为8-20min,得到酶解溶液;于酶解液中加入10-15μL稳定同位素标记的特征肽段和内标肽段,涡流混匀,将所述特征肽段和所述内标肽段混合酶解,然后使用液相色谱串联质谱仪将酶解后的反应液进行液相色谱-质谱分析,将所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线,得单克隆抗体药物浓度。

2.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法,其特征在于:步骤S2中,所述系列标准溶液设置为五份,其浓度分别为5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L。

3.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法,其特征在于:步骤S3中,所述健康受试动物为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法,其特征在于:步骤S3中,分离血浆,得到血浆样品的具体操作为:吸取血液样品于加有乙二胺四乙酸二钠抗凝的离心管中,静置20min,然后在4℃环境下进行10-12min离心,离心转速为3000rpm,即可分离血浆,得到血浆样品。

5.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法,其特征在于:步骤S3中,使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液的具体操作为:分别取不同浓度的系列标准溶液100μL置于离心管中,然后分别置于氮吹仪中水浴40℃吹干;吹干后加入血浆样品100μL,涡旋混合1min,依次加入10μL内标工作液、300μL甲醇,混合均匀,置于高速离心机中12000rpm离心5min得到上清液;将上清液置于离心管中,置于氮吹仪中水浴40℃吹干,在吹干的残渣中加入200μL甲醇复溶,涡旋30s,再次离心得到上清液,即为血浆溶液。

6.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法,其特征在于:步骤S6中,所述血液样品与pH缓冲液、还原剂的加入配比为1:48-50:1。

7.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法,其特征在于:步骤S8中,所述液相色谱-质谱分析中的液相色谱条件为:采用PeptideCSHTMC18色谱柱,所述色谱柱的规格为2.1mm×100mm,1.8μm;柱温为40~41℃;流动相A为甲酸体积百分数占0.15~0.2%的水;流动相B为甲酸体积百分数占0.15~0.2%的乙腈;进行梯度洗脱50~60min,进样量为8~10μl,流速为0.25~0.35ml/min。

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