[发明专利]一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法

权利要求书

1.一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

S1、以生物靶向药物作为待分析的单克隆抗体药物，并定量称取，将其配制成原料药溶液；

S2、使用溶剂将原料药溶液分别稀释成不同浓度梯度的药液，并将该不同浓度的溶液作为系列标准溶液，以原料药溶液的总浓度作为标示量，计量各标准溶液中各组分的相对浓度；

S3、以灌胃或静脉注射的方式将步骤S2中制备的系列标准溶液给予健康受试动物，并分别收集动物血液样品于聚乙烯管中，分离血浆，得到血浆样品，使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液；

S4、向各血浆溶液中分别加入pH为5.0-9.0，浓度为5-500mmol/L的HEPES缓冲液，涡流混匀，在40-60℃条件下孵育50-80min，得到反应前溶液；

S5、向上述得到的反应前溶液中分别加入二甲基标记试剂1，在10-30℃条件下反应10-50min；

S6、向步骤S4处理后的溶液中加入含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀；再加入还原剂，涡流混匀；在60℃条件下孵育60-70min，得到反应液，然后再分别向体系中加入二甲基标记试剂2，在30-60℃条件下反应80-200min；最后加入100-1000mmol/L的NH₄HCO₃，终止标记反应；

S7、将步骤S6得到的溶液加入Glu-C对蛋白质进行酶解处理，蛋白质与酶的比例保持在1：25-100之间，酶解温度控制20-37℃，酶解时间为8-20min，得到酶解溶液；于酶解液中加入10-15μL稳定同位素标记的特征肽段和内标肽段，涡流混匀，将所述特征肽段和所述内标肽段混合酶解，然后使用液相色谱串联质谱仪将酶解后的反应液进行液相色谱-质谱分析，将所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线，得单克隆抗体药物浓度。

2.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征在于：步骤S2中，所述系列标准溶液设置为五份，其浓度分别为5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L。

3.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征在于：步骤S3中，所述健康受试动物为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征在于：步骤S3中，分离血浆，得到血浆样品的具体操作为：吸取血液样品于加有乙二胺四乙酸二钠抗凝的离心管中，静置20min，然后在4℃环境下进行10-12min离心，离心转速为3000rpm，即可分离血浆，得到血浆样品。

5.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征在于：步骤S3中，使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液的具体操作为：分别取不同浓度的系列标准溶液100μL置于离心管中，然后分别置于氮吹仪中水浴40℃吹干；吹干后加入血浆样品100μL，涡旋混合1min，依次加入10μL内标工作液、300μL甲醇，混合均匀，置于高速离心机中12000rpm离心5min得到上清液；将上清液置于离心管中，置于氮吹仪中水浴40℃吹干，在吹干的残渣中加入200μL甲醇复溶，涡旋30s，再次离心得到上清液，即为血浆溶液。

6.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征在于：步骤S6中，所述血液样品与pH缓冲液、还原剂的加入配比为1：48-50：1。

7.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征在于：步骤S8中，所述液相色谱-质谱分析中的液相色谱条件为：采用PeptideCSHTMC18色谱柱，所述色谱柱的规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温为40～41℃；流动相A为甲酸体积百分数占0.15～0.2％的水；流动相B为甲酸体积百分数占0.15～0.2％的乙腈；进行梯度洗脱50～60min，进样量为8～10μl，流速为0.25～0.35ml/min。