[发明专利]一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法

说明书

本发明属于蛋白质组学技术领域，具体公开了一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，对单克隆抗体药物的酶解特异性肽段进行分析和定量，对变性前后的药液进行两步稳定同位素共价化学标记，使用液相色谱串联质谱仪将酶解后的反应液进行液相色谱‑质谱分析，将所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线，具有高通量、灵敏度高、重现性好等特点，简单易行，不仅适用于本发明中所述的单克隆抗体药物，对其他蛋白类药物和多肽药物的定性和定量研究也具有指导借鉴意义。

技术领域

本发明涉及蛋白质组学技术领域，具体为一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法。

背景技术

抗体是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体(McAb),简称单抗。单抗药物一般分为:治疗疾病(尤其是肿瘤)的单抗药剂、抗肿瘤单抗偶联物、治疗其他疾病的单抗。单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。单克隆抗体药物在生物技术制药中占有重要地位，并逐渐成为生物医药领域发展的主要方向。

同传统的小分子药物或中药制剂相比，单克隆抗体药物有着明确的药理活性和优异的药动学性质；单克隆抗体在体内代谢程度较低，可在体液中长期保持较高浓度，血清消除半衰期平均长达数周至数月。因此，及时建立规范可靠的分析方法并开展单克隆抗体药物药代动力学研究对于支持单克隆抗体药物研发具有十分重要的意义。

然而，在单克隆抗体药代动力学实验中，现有技术定量范围较窄，不能对不同形态的单抗药物进行同时分析，且存在开发周期长，成本高，无法区分内源性蛋白的干扰等问题，大大影响了ELISA定量的可靠性和实用性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，包括如下具体步骤：

S1、以生物靶向药物作为待分析的单克隆抗体药物，并定量称取，将其配制成原料药溶液；

S2、使用溶剂将原料药溶液分别稀释成不同浓度梯度的药液，并将该不同浓度的溶液作为系列标准溶液，以原料药溶液的总浓度作为标示量，计量各标准溶液中各组分的相对浓度；

S3、以灌胃或静脉注射的方式将步骤S2中制备的系列标准溶液给予健康受试动物，并分别收集动物血液样品于聚乙烯管中，分离血浆，得到血浆样品，使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液；

S4、向各血浆溶液中分别加入pH为5.0-9.0，浓度为5-500mmol/L的HEPES缓冲液，涡流混匀，在40-60℃条件下孵育50-80min，得到反应前溶液；

S5、向上述得到的反应前溶液中分别加入二甲基标记试剂1，在10-30℃条件下反应10-50min；

S6、向步骤S4处理后的溶液中加入含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀；再加入还原剂，涡流混匀；在60℃条件下孵育60-70min，得到反应液，然后再分别向体系中加入二甲基标记试剂2，在30-60℃条件下反应80-200min；最后加入100-1000mmol/L的NH₄HCO₃，终止标记反应；

S7、将步骤S6得到的溶液加入Glu-C对蛋白质进行酶解处理，蛋白质与酶的比例保持在1：25-100之间，酶解温度控制20-37℃，酶解时间为8-20min，得到酶解溶液；于酶解液中加入10-15μL稳定同位素标记的特征肽段和内标肽段，涡流混匀，将所述特征肽段和所述内标肽段混合酶解，然后使用液相色谱串联质谱仪将酶解后的反应液进行液相色谱-质谱分析，将所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线，得单克隆抗体药物浓度。