[发明专利]一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的广谱型荧光探针的应用

说明书

一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的广谱型荧光探针的应用，其属于生物医药技术领域。该特异性探针底物可用于测定生物体系中CYP3A的酶活性。CYP3A酶活性测定的流程如下：选择BN类化合物4‑位羟化反应为探针反应，通过定量检测单位时间内其羟化代谢产物的生成量来测定各类生物样品中CYP3A酶的活性。BN系列探针可同时检测CYP3A4和CYP3A5的活性，是检测CYP3A活性的广谱型探针，由此可以实现CYP3A相关的基于机理抑制剂的高效发现和深入研究。该探针还可用于体外快速筛选CYP3A的可逆及不可逆抑制剂、激活剂及诱导剂，并用以检测CYP3A在活体层面药‑药相互作用。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的双光子荧光探针及其应用。

背景技术

细胞色素P450为一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族，在多种内源物及外源物如药物、致癌物、环境污染物等物质的代谢过程中发挥着重要作用。CYP3A是细胞色素P450的重要亚家族，CYP3A4和CYP3A5是人体CYP3A亚家族的核心成员，二者的表达量约占肝脏中总P450含量的30％以上，参与约50％以上临床用药的Ⅰ相代谢，是介导人体内药物代谢的关键代谢靶点之一。

CYP3A4和CYP3A5具有较大的底物空腔，对具有各种结构骨架的底物包容度好、底物谱广泛，这也是CYP3A极易介导药物相互作用的根源。不仅如此，CYP3A可介导药物的代谢激活，催化生成的高活性代谢产物一方面可能与CYP3A酶空腔内的氨基酸共价结合而导致CYP3A酶活不可逆丧失，另一方面，高活性代谢产物还可能与细胞内的关键靶点共价结合而诱发难以预料的肝毒性、和肝癌等毒性效应。

基于机理的酶失活过程(MBI)可将非活性底物转化为高活性的亲电代谢产物，通过对酶催化腔内关键氨基酸基团的共价修饰，导致对目标酶的不可逆抑制。不幸的是，由MBI诱导的代谢酶的“不可逆”和“自杀”抑制通常与严重的不良反应有关，有时会危及生命健康(Chem.Rev.2018,118,4037-4070)。与可逆抑制相比，代谢酶的MBI经常引起不利的药物相互作用。此外，形成的活性代谢物会诱发药物的不良途径，因为它们会引发生物大分子的不可逆共价修饰，最终导致毒性。这种间接影响通常更难以预测，并且与毒性事件密切相关。因此，关键代谢酶的基于机理的抑制剂的发现和评估对于药物的开发和安全使用以及公共卫生具有重要意义。

目前研究表明，CYP3A在介导药物发生基于机理的抑制过程中起到了举足轻重的作用。因此，开发可灵敏监测CYP3A活性的广谱型荧光探针是助力发现和评估MBI相关的生物学效应的重要工具。

光谱探针在检测基于机理的抑制剂时具有更突出的优势，主要原因如下：1)CYP3A4和CYP3A5的底物谱，虽然非常相似，但并不完全重叠(Curr Drug Metab.2008,9:20)；2)CYP3A4和CYP3A5的表达水平以及它们相对于总CYP3A的比例在个体和不同生物样本中是存在显著波动的(Trends Pharmacol.Sci.2003,24:161；Drug Metab.Dispos.2019,47:1257)。因此，单独检测CYP3A4或CYP3A5，但不能同时检测CYP3A4和CYP3A5的荧光探针，不能有效评估CYP3A的基于机理的抑制行为。换句话说，对CYP3A4或CYP3A5活性的单独测量可能无法准确揭示生理环境中的真实的基于机理的抑制效应。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，开发CYP3A广谱探针以便实现CYP3A相关的基于机理抑制剂的高效发现和深入研究，开发高选择性的CYP3A的双光子荧光探针反应及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。本发明的目的在于提供一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的双光子型荧光探针及其应用，该双光子型荧光探针底物没有荧光，羟化产物具有荧光，且具有双光子性质，能够减少背景荧光干扰。利用该探针反应可对多种生物体系中CYP3A的分布和功能进行定量评价。