[发明专利]一种基于磁性微球共培养的粘性物质holdfast的富集方法

说明书

本发明公开了一种基于磁性微球共培养的粘性物质holdfast的富集方法。该方法首先使用磁性微球与新月柄杆菌共培养，然后使用磁力架将富集了分泌holdfast的新月柄杆菌的磁性微球与与未分泌holdfast的新月柄杆菌分离，最后提纯并获得holdfast。本发明使用的单分散磁性微球使得新月柄杆菌更容易接触粘附在球体表面，可以高效的富集holdfast，通过对微球材质、微球粒径、共培养、富集和纯化等各种条件进行了优化，确定了该磁性微球的指标参数和制备技术规范，实现了holdfast的良好富集效果。

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种超高粘性物质holdfast的磁性微球富集方法。

背景技术

目前面世的粘性材料主要为化学合成材料，然而随着化学合成工艺日渐成熟，粘性材料的性能提升也遇到了瓶颈。自然界中存在很多天然粘性物质，比现有的化学粘性材料强度更高，新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)能够分泌一种超高粘性的物质-holdfast(Characterization of the Adhesive Holdfast of Marine and FreshwaterCaulobacters)，研究表明，holdfast的粘性强度可达68N/mm²。holdfast具有良好的防水性、耐腐蚀性、生物相容性、多界面适用性。但是由于其分泌量小，难以富集，目前尚无大量制备holdfast的方法。

新月柄杆菌的生长周期比一般细菌较长，约16-24小时，而holdfast的分泌阶段一般只占其生长周期的四分之一。已知holdfast的分泌受鞭毛接触刺激影响，在培养过程中菌体互相粘连成菌团会导致holdfast更难分离，同时在纯化holdfast的过程中难以去除菌体物质的污染。除了菌体自身粘连造成的难以分离holdfast，培养容器的内壁上也容易粘附大量菌体，影响holdfast的富集效率。

使用微球富集新月柄杆菌holdfast可以提升菌体接触刺激，分泌更多holdfast；然而常规微球由于自发沉降造成holdfast与菌体的分离困难。现有研究中富集holdfast的方法为棉片吸附，该方法富集量大，但存在着分离纯化难、棉片成分对后续分析有影响等缺点。单分散磁性微球具有多种材质、粒径，在水中分散性好，容易与新月柄杆菌充分接触发生粘附作用。而且由于其磁性特征，可以通过磁力架进行吸附洗涤，因此成为富集新月柄杆菌holdfast的最佳材料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于磁性微球共培养的粘性物质holdfast的富集方法。

一种基于磁性微球共培养的粘性物质holdfast的富集方法，按照如下步骤进行：

(1)使用磁性微球与新月柄杆菌共培养；

(2)使用磁力架将富集了分泌holdfast的新月柄杆菌的磁性微球与与未分泌holdfast的新月柄杆菌分离；

(3)提纯并获得holdfast。

所述磁性微球内含磁性Fe₃O₄，外包材质为SiO₂，粒径40μm。

所述共培养的条件为温度25-35℃、转速200-300rpm、离心力1.2-1.8g。

步骤(2)所述分离方法为：将培养结束的磁性微球菌液倒入40-60mL离心管中并置于磁力架上，8-12s内匀速翻转8-12次磁力架使磁性微球吸附在磁力架一侧，打开管盖，移除管中菌液；加入40-60mL去离子水，盖上管盖，拿起离心管翻转8-12次洗涤磁性微球，再次放入磁力架，8-12s内匀速翻转8-12次磁力架使磁性微球吸附在磁力架一侧，打开管盖，移除管中液体，重复洗涤2-4次。

步骤(3)所述提纯方法为：

(1)将洗涤后的磁性微球用1mL的PBS重悬，转移至1.5mL离心管中；