[发明专利]真核细胞S-腺苷甲硫氨酸浓度感知荧光报告系统

权利要求书

1.一种实时感知真核细胞SAM浓度的系统,其特征在于，构建方法为：

分别构建AAVS1_Hygro_CMV_3nat_EGFP和AAVS1_Hygro_CMV_NS44_RFP载体，利用CRISPR-Cas9体系特异剪切人类第19号染色体上的AAVS1位点，将两条供体片段整合到基因组上的安全位点；所述的3nat序列为SEQ ID NO:4，所述的NS44序列为 SEQ ID NO:9；所述SAM为S-腺苷甲硫氨酸；

通过潮霉素B药物筛选实现等位基因定点插入，并通过RCR鉴定和DNA测序获得定点插入的细胞系；

在所述的细胞系中，通过病毒包装系统，过表达KRAB MetJ表达载体，以此构建SAM浓度感知双荧光报告系统；

所述构建病毒包装系统的方法为通过KRAB MetJ-PCW57.1质粒与 P/G质粒，VSVG质粒，进行三质粒瞬转，培养后后产生慢病毒，利用此病毒感染所述细胞系。

2.根据权利要求1所述的实时感知真核细胞SAM浓度的系统，其中，所述的细胞系为HEK293T。

3.一种SAM浓度检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的实时感知真核细胞SAM浓度的系统。

4.一种筛选调控SAM代谢的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

根据权利要求1-2任一项所述的系统构建稳定表达Cas9蛋白的细胞系，使用GeCKO慢病毒文库进行全基因组范围的筛选；

通过病毒感染sgRNA质粒文库后敲除基因，通过流式细胞分选获得不同集群，通过PCR特异地扩增出不同集群的基因序列信息，将来自功能性筛选富集获得的细胞和未经过处理的原文库细胞的PCR扩增序列，通过深度测序分析及比较，可以获得被富集的sgRNA序列信息以及其所对应的基因，依次获得调控SAM代谢的潜在基因。