[发明专利]真核细胞S-腺苷甲硫氨酸浓度感知荧光报告系统

说明书

本发明属于生化检测领域，涉及一种真核细胞S‑腺苷甲硫氨酸浓度感知荧光报告系统，填补了活细胞内SAM浓度灵敏检测的技术空白，同时实现了调控SAM代谢的功能基因筛选。首先公开了一种基于大肠杆菌蛋氨酸代谢途径中MetJ阻遏蛋白和met‑box序列的结合偏好性，利用AAVS1定点插入构建的真核细胞的SAM感知系统。主要包括：S1：从MetJ蛋白结合的候选序列中确定可实时反映SAM浓度的met‑box序列,并筛选优选序列；S2：利用AAVS1定点插入荧光报告序列，获得等位基因双荧光报告系统；S3：将MetJ蛋白和Cas9蛋白构入报告系统，获得可感知SAM浓度的双荧光报告系统。本发明提供了一种真核细胞SAM浓度实时感知荧光报告系统，利用此系统可检测活细胞内SAM浓度并筛选调控SAM代谢的相关基因。

技术领域

本发明属于生化检测领域，尤其涉及一种真核细胞S-腺苷甲硫氨酸浓度实时感知荧光报告系统。

背景技术

在蛋氨酸循环中，SAM具有重要的作用。甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)催化蛋氨酸与ATP形成SAM，在转甲基反应中，SAM的甲基基团转移到不同的生物受体过程中，转变成S-腺苷高半胱氨酸(SAH)。SAH在水解酶作用下进一步转变成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷。高半胱氨酸有两种命运：被重新甲基化以再生蛋氨酸，或进入转硫途径被转化为半胱氨酸和α-酮丁酸酯。从生理学方面来看SAM作为甲基供体，参与DNA、RNA和蛋白甲基化。其中的甲基可转移到C，S,N，O原子中，参与到合成与代谢过程中。此外，多种含硫物质的合成均离不开SAM的辅助，在转硫作用的影响下，SAM会产生大量半胱氨酸，经代谢转化为谷胱甘肽，谷胱甘肽是人体的硫储存库。SAM经过脱羧反应后，生产经过脱羧处理后形成多胺，如腐胺，亚精胺，精胺等，促进组织生长。SAM在转甲基作用的影响下，可促进磷脂的甲基化，调节细胞膜的流动，在转硫途径中，生成的GSH是细胞主要的抗氧化剂。SAM脱羧形成的多胺可促进细胞再生，多胺的缺乏会影响细胞的正常分裂与DNA合成。

SAM是所有细胞中的重要中间代谢产物，特别是在甲基和丙氨基生物转化中起到了核心作用。在大肠杆菌中，MetJ作为抑制因子，它控制参与蛋氨酸生物合成和转运的基因的表达。SAM与MetJ的结合调节了MetJ在细胞中的功能。当蛋氨酸丰富时，SAM积累促进SAM-MetJ-蛋白质复合物的形成，两个MetJ二聚体与DNA双链体结合，抑制Met生物合成和转运的基因的表达。研究人员在大肠杆菌体外实验中，验证出不同浓度SAM情况下，MetJ对不同met-box的结合力不同，此实验结果表明大肠杆菌中的蛋氨酸代谢机制在体外同样可靠(Augustus AM,Sage H,Spicer LD.Binding of MetJ repressor to specific andnonspecific DNA and effect of S-adenosylmethionine on these interactions.Biochemistry.2010Apr；49(15):3289-3295.)。虽然甲基化修饰的研究已经取得很多进展，但是人们对甲基化修饰涉及到的基因网络集群的整体认识还不全面,尤其在相关疾病的形成和治疗靶点的选择方面还存在一定的空白有待进一步的研究。

很多疾病的形成和治疗都与SAM失调相关，如阿尔茨海默病、抑郁症、HIV相关神经功能障碍/痴呆、多发性硬化症、帕金森病、慢性肝功能障碍、动脉硬化和癌症等。研究表明；SAM供给失衡会导致肝脏细胞基因表达改变，引发肝癌。SAM是大脑中多种甲基化反应的甲基供体，包括参与神经递质代谢的甲基反应，而缺乏神经递质和抑郁症有关，而高半胱氨酸的水平升高会引发阿茨海默氏病。此外，SAM与肿瘤密切相关。肿瘤的标志为低甲基化，SAM浓度降低，通过提高SAM浓度可以在一定程度上抑制肿瘤发生。

发明内容

机体内的SAM供给平衡是非常重要的，但是活细胞内进行SAM浓度测定还处于空白。本发明的技术方案通过结合大肠杆菌蛋氨酸代谢调控机制、AAVS1等位基因定点插入、转录组学分析等提供一种实时感知真核细胞SAM浓度的系统，同时也获得了一个可用于全基因组筛选调控SAM代谢的相关基因的系统，将为探究与SAM循环相关的潜在基因以及疾病形成提供基础。