[发明专利]MAD7-NLS融合蛋白、用于植物基因组定点编辑的核酸构建物及其应用

权利要求书

1.一种MAD7-NLS融合蛋白，其特征在于，具有如下结构：

B1-C-B2、B1-C或C-B2；

其中，

C为MAD7蛋白；

B1和B2为各自独立的核定位信号序列。

2.如权利要求1所述的MAD7-NLS融合蛋白，其特征在于，所述核定位信号序列选自：SV40、KRP2、MDM2、CDc25C、DPP9、MTA1、CBP80、AreA、M9、Rev、hTAP、MyRF、EBNA-6、TERT或Tfam中的一种，或者任两种或多种的组合。

3.如权利要求1或2所述的MAD7-NLS融合蛋白，其特征在于，所述MAD7-NLS融合蛋白N端还包含信号肽和/或蛋白标签序列。

4.一种用于植物基因组定点编辑的核酸构建物，其特征在于，包含第一表达盒，所述第一表达盒包含依次连接的第一启动子、如权利要求1-3中任一项所述的MAD7-NLS融合蛋白的编码核苷酸序列和第一终止子。

5.如权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于，所述第一启动子为Pol II类型的启动子，选自Ubi、Actin、CmYLCV、UBQ、35S、SPL，组织特异性启动子YAO、CDC45、rbcS和诱导型启动子XEV中的一种或任两种的组合。

6.如权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于，还包含第二表达盒，所述的第二表达盒包含依次连接的第二启动子、若干串联的重复序列；

所述重复序列为成熟型直接重复序列和非成熟型直接重复序列中的一种或两种。

7.如权利要求6所述的核酸构建物，其特征在于，第二启动子为Pol II类型或Pol III类型的启动子；所述第二启动子选自OsU3、OsU6a、OsU6b、OsU6c、Actin、35S、Ubi、UBQ、SPL、CmYLCV、组织特异性启动子YAO、CDC45、rbcS或诱导型启动子XEV中的一种、两种或多种。

8.如权利要求6所述的核酸构建物，其特征在于，所述第二表达盒还包含连接于重复序列末端的第二终止序列；所述第二终止序列选自polyT、NOS、polyA或其组合。

9.如权利要求6所述的核酸构建物，其特征在于，所述重复序列还包含目标位点引导序列sg；所述的目标位点引导序列sg的长度为17-35bp和/或所述重复序列重复数为2-50。

10.如权利要求9所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物为选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:21中的一个或多个。

11.如权利要求4-10中任一项所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物为同时包含第一表达盒和第二表达盒的载体，或者，

由分别包含第一表达盒的第一载体与包含第二表达盒的第二载体组成的载体组合。

12.一种用于植物体基因编辑的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4-11中任一项所述的核酸构建物。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，还包括携带供体DNA表达盒的辅助载体。

14.一种用于植物基因编辑的方法，其特征在于，包括：

（i）将权利要求4-11任一项所述的核酸构建物和任选的供体核酸片段，导入到植物细胞、植物组织或植物体，并在所述植物细胞、植物组织或植物体中进行基因编辑；

（ii）对发生所述基因编辑的植物细胞、植物组织或植物体进行筛选和鉴定；

（iii）将步骤（ii）中经鉴定发生了所述基因编辑的植物细胞、植物组织或植物体进行再生或培养；

所述的植物选自禾本科植物、豆科植物、茄科或十字花科植物中的任一种。