[发明专利]MAD7-NLS融合蛋白、用于植物基因组定点编辑的核酸构建物及其应用

说明书

本发明提供一种MAD7‑NLS融合蛋白，具有以下结构：B1‑C‑B2、B1‑C或C‑B2，其中，C为MAD7蛋白；B1和B2各自独立地为核定位信号序列(NLS)。本发明还提供了用于植物基因组定点编辑的核酸构建物，包含第一表达盒，第一表达盒包含依次连接的第一启动子、MAD7‑NLS融合蛋白的编码核苷酸序列和第一终止子。本发明还提供了该核酸构建体在植物基因编辑中的应用。本发明利用MAD7能够在预定的植物基因组位点简便而高效地进行单基因敲除、多基因敲除或者同源重组和外源片段的定向插入。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及MAD7-NLS融合蛋白、用于植物基因组定点编辑的核酸构建物，以及基于新型核酸酶MAD7利用RNA引导的植物基因组的高效定点基因编辑方法。

背景技术

随着基因定向编辑工具如锌指蛋白核糖核酸酶（Zinc finger nulease， ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（Transcription activator-like effectors nulease，TALEN）和规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）系统的推广应用，特别是CRISPR系统由于活性高，特异性好、操作简便、快速，近年来发展非常迅速，并且在大量物种上得到成功应用。目前应用最广的核酸酶为II型Cas9和Cpf1（Cas12a）。其中，Cas9识别3′G-rich 位点，而Cpf1（Cas12a）识别5′A-T rich位点。而相对Cas9来说，Cas12a蛋白兼具DNA剪切酶和RNA修剪酶的功能，不但能够靶向切割DNA双链，而且能把相应的非成熟型crRNA（pre-crRNA）加工剪切成成熟型crRNA（Fonfara et al.,2016），且不需要tracrRNA的参与；同时，Cas12a蛋白分子相对更小，特异性更强，相对Cas9对多靶点基因编辑具有更强的优势；另外，相对于Cas9剪切基因组形成的是平末端，Cas12a剪切基因组形成的粘性末端更有利于外源基因的定向插入。

MAD7隶属于II型V-A Cpf1-like家族，由Inscripta公司发现于真杆菌属并经优化改造，可供科研院所和商业研究免费使用。MAD7同AsCpf1蛋白同源性最高，同源度也仅为31%，PAM识别位点为YTTN，目前MAD7系统已在细菌、酵母、斑马鱼、小鼠和人体细胞中验证具有较高编辑活性，为推广其植物中应用范围，将其水稻密码子优化后研究其在植物中编辑效率。尽管近期MAD7系统亦已报道在水稻中的应用，但其突变效率49-65.6%。综上所述，为了满足植物基因工程的需要，丰富植物基因编辑的工具箱，有必要开发更高效的基因编辑系统具有较强优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一套基于MAD7的CRISPR/MAD7植物基因组高效定点编辑系统，可以简单高效地在单双子叶植物实现单基因敲除、多基因敲除和同源重组或外源片段定点敲入。

本发明首先提供了一种MAD7-NLS融合蛋白，具有以下结构：

B1-C-B2、B1-C或C-B2；

其中，

C为MAD7蛋白；

B1和B2为各自独立的核定位信号序列(NLS)。

在根据本发明的一个实施方案中，所述核定位信号序列(NLS)选自：SV40、KRP2（Kiprelated protein gene NO .2）、MDM2、CDc25C、DPP9、MTA1、CBP80、AreA、M9、Rev、hTAP、MyRF、EBNA-6、TERT或Tfam中的一种或者任两种或多种的组合。

在根据本发明的一个实施方案中，所述MAD7-NLS融合蛋白的N端还包含信号肽和/或蛋白标签序列。

本发明的另一方面提供了一种用于植物基因组定点编辑的核酸构建物，包含第一表达盒，所述第一表达盒包含依次连接的第一启动子、如上述的MAD7-NLS融合蛋白的编码核苷酸序列和第一终止子；