[发明专利]动态交联水凝胶培养细胞的应用

说明书

本发明涉及一种动态交联水凝胶的应用。所述动态交联水凝胶具体地由明胶和交联基团修饰的环糊精混合形成的水凝胶预聚体，混入胚胎干细胞或免疫细胞后，在交联引发剂或紫外光的作用下发生交联反应得到的动态交联水凝胶。所述水凝胶在无需饲养层细胞或分化抑制剂的基础培养基中长期培养胚胎干细胞并保持其干性，操作简单，适宜规模化培养。负载有免疫细胞的水凝胶可直接应用于生物体内的注射和填充。

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，更具体的说，涉及一种动态交联水凝胶在3D培养细胞中的应用。

背景技术

由于细胞聚集团簇被广泛应用于药物筛选体外模型、疾病进展和发育生物学的基础研究以及自体或异体器官培植和组织再生的临床研究领域等等，因此利用水凝胶对细胞团簇进行增殖培养、细胞学研究、细胞释放收集及作为组织工程支架装载细胞用于组织再生等具有重大生物医学意义和应用前景。

现有技术在体外培养细胞中，对那些成团生长的细胞，如何在培养过程中抑制分化仍是一个重要的因素。例如，在胚胎干细胞的增殖培养中，为抑制其分化可使用经紫外线照射后停止分裂的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞。胚胎干细胞(ESCs)是一种典型的成团培养细胞系。一般而言，ESCs的常规二维(2D)培养需要与小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)即饲养层细胞或培养基补充剂如GSK3β和Mek1/2抑制剂(简称2i)共培养，以抑制自发分化。然而，在长期培养中保持ESCs处于未分化状态仍然具有挑战性。更重要的是，与体外在二维表面上培养的ESCs不同，在胚胎发育期间，内部细胞团里的细胞是与三维(3D)的细胞外基质(ECM)相互作用，后者能调节ESCs的自我更新和分化。细胞和周围ECM之间的相互作用对于胚胎干细胞增殖、干性维持、定向分化和器官形成至关重要。但是上述二维培养细胞的方法中，无论是使用饲养层细胞的方式，还是采取加入分化抑制剂的方法，在培养过程中维持未分化状态仅可持续数日，还没有一种可长期支持细胞团簇生长的方法。

三维生物材料支架，如水凝胶，有望在没有饲养层且不需要频繁传代培养的情况下辅助胚胎干细胞的长期培养。虽然已经有大量关于水凝胶体系应用于体外细胞三维培养的研究，但是这些工作还存在一些有待解决的问题。现有的体外培养胚胎干细胞的方法无法得到较大、尺寸均一团簇的细胞克隆，同时在长时间培养过程中，难以保持胚胎干细胞的干性。冯茜等人报道了一种基于明胶的主客体超分子组装水凝胶在培养间充质干细胞中的应用，在14天内，间充质干细胞分化为星型骨细胞，并可注射于小鼠的关节部位。但是没有报道该水凝胶可长期三维培养胚胎干细胞，同时保持其干性。

随着免疫治疗的快速发展，免疫细胞的体外培养也日益得到研究人员的重视。传统的免疫细胞培养采用二维培养或悬浮培养的方式，为得到好的细胞增殖效果，往往添加各种辅助试剂，例如分化抑制剂，悬浮培养时往往需要防止细胞沉积的添加物等。部分培养方法获得的细胞生长不均一，受生长环境和实验操作的影响较大，不适宜规模化的培养。

发明内容

本申请的目的之一是提供一种基于明胶的动态交联水凝胶在体外培养细胞中的应用。所述动态交联水凝胶，是由明胶和交联基团修饰的环糊精混合形成的水凝胶预聚体，在交联引发剂或光照下发生交联反应得到的动态交联水凝胶；其中所述细胞为胚胎干细胞或免疫细胞。

在一种优选的实施方式中，所述交联基团修饰的环糊精是丙烯酸酯化环糊精，在某些实施方式中，所述丙烯酸酯化环糊精是β-环糊精。

在一种实施方式中，所述水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)丙烯酸酯化β-环糊精制备步骤：

将β-环糊精溶解于二甲基甲酰胺(DMF)得到1-10％(w/v)的β-环糊精/DMF溶液，以0.75-7.5％(v/v)比例加入三乙胺，将体系温度降至0℃；向体系中逐滴加入环糊精摩尔量4-8倍量的丙烯酰氯，滴加结束后持续搅拌12小时，抽滤除去三乙胺盐酸盐，获得澄清溶液即反应产物；通过真空旋转蒸发浓缩反应产物，将反应产物浓缩液滴加到丙酮中得到白色沉淀，并将所得到的白色沉淀用丙酮洗涤，最后真空干燥得到丙烯酸酯化β-环糊精(Ac-CD)；