[发明专利]基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂

权利要求书

1.基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂，其特征在于通过弱化高附加值代谢物的关键性酶基因表达，采用自动化技术，结合突变-筛选-突变的闭环式蛋白进化方法，从迭代的关键性酶基因突变文库中筛选出效率高的关键性酶突变体基因。

2.如权利要求1所述的基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂，其特征在于所述高附加值代谢物包括类黄酮化合物、类黄酮化合物衍生物、类黄酮化合物经修饰后的化合物，所述类黄酮化合物包括柚皮素、花青素、黄芩素或生松素。

3.如权利要求1所述的高附加值代谢物智能细胞工厂的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将目标代谢物的关键性酶基因克隆至低拷贝数、弱启动子的质粒中，得到含有关键性酶基因的质粒；

(2)以上述步骤(1)得到的含有关键性酶基因的质粒为模板，采用易错PCR技术制备突变文库，结合Gibson技术，将上述突变文库连接至低拷贝数质粒上，经抗生素平板筛选质粒，经电转化至BL21(DE3)感受态，得到关键性酶基因突变文库；

(3)采用QPix自动化挑菌设备挑取上述步骤(2)得到的关键性酶基因突变文库中的突变体，进行发酵培养，得到突变体发酵液；

(4)采用自动化移液工作站移取上述步骤(3)得到的突变体发酵液，自动化测定关键性酶基因突变文库目标代谢物的产量初筛；

(5)采用自动化移液工作站移取上述步骤(4)中高产量的目标代谢物的突变体发酵液，定量测定目标代谢物的产量；

(6)重复上述步骤(1)-(5)，直至目标代谢物的产量不再提高为止，即得到关键性酶基因的目标突变体。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中抗生素平板包括氯霉素平板或链霉素平板。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中发酵培养的具体操作为：将挑取的突变体置于深孔板中，运用自动化机械臂，转移至高速摇床培养过夜，以0.5-3％接种量转移至发酵培养基中，培养1-3天。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中自动化测定关键性酶基因突变文库目标代谢物的产量初筛的具体步骤为：测定荧光与UV信号，即为数值A，加入显色剂，测定数值为B，根据计算机编译程序自动计算B-A的数据，即为目标代谢物的产量初筛。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(5)中定量测定目标代谢物的产量的具体步骤为：将高产量的目标代谢物的突变体发酵液与等体积无水乙醇混合，静置，采用自动化机械臂转移样品至离心机中离心，采用自动化移液工作站转移上清液至深孔板，利用HPLC方法定量突变体目标代谢物的产量。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述静置的时间为20-60分钟，所述离心的条件为：转速4000-12000rpm，时间5-30分钟。

9.如权利要求1-2任一所述的高附加值代谢物智能细胞工厂在高附加值代谢物高效合成上的应用。

10.如权利要求3-8任一所述的构建方法在利用自动化技术对高附加值化合物代谢通路关键性酶连续进化上的应用。