[发明专利]基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂

说明书

基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂，属于代谢工程技术领域。本发明包括通过弱化高附加值代谢物的关键性酶基因表达，采用自动化技术，结合突变‑筛选‑突变的闭环式蛋白进化方法，从迭代的关键性酶基因突变文库中筛选出效率高的关键性酶突变体基因。还提供了一种高附加值代谢物智能细胞工厂的构建方法和应用。本发明可有效解决目前高附加值代谢物无高通量分子探针或者分子探针筛选不稳定的问题，减少人力成本，缩短蛋白进化时间，减少中间产物与终产物抑制效应，增强核心代谢通量，实现高附加值化合物高效合成。

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，具体涉及基于自动化技术构建的高附加值代谢物智能细胞工厂。

背景技术

植物富含生理活性的天然产物(如萜类、生物碱、聚酮类化合物、黄酮类化合物等)，具有抗菌消炎抗癌等生理活性。自然条件多变、提取成本昂贵、产品纯度低等因素限制这些高附加值物质的市场供应。相比植物提取法，微生物合成法因发酵周期短、生产成本低、产品纯度高、环境友好等优势而被广泛关注。随着测序技术、基因操作技术的发展，国内外研究者已系统性建立各类底盘(如大肠杆菌、酵母菌、放线菌)的分子工具，便于外源途径克隆至微生物。

细胞需20-30％的能量用于蛋白合成，这些蛋白质参与各类小分子合成，用于组成细胞基本骨架与生长所需。外源天然产物合成途径导入微生物时，易打破生长所需平衡，诱发细胞生理环境改变或毒性信号产生，进而限制其产量。因此，理性设计微生物内源代谢网络与外源途径，可有效扭转微生物目标代谢物产量低的现状。系统生物学技术如基因组代谢网络技术可全局分析微生物代谢网络，便于后期理性改造关键性节点，进而提高目标代谢物产量。例如，OptForce工具可理性预测提高胞内丙二酰辅酶A含量的基因调控的最优方案，即敲除sucC和fumC基因，并强化pdh、pgk、gapd和acc等基因，最终，细胞内丙二酰辅酶A含量提高4倍，且柚皮素产量提升至474mg/L。理性改造天然产物外源途径为其目标代谢物产量提高的另一有效方法：分别进化核心代谢流各关键性酶，进而增强各代谢反应转化率、减少溢流、弱化中间产物与终产物毒性，实现底盘细胞正常生长情况下的核心代谢通路资源分配的最优解。

合成生物学打破了传统“格物致知”的研究思路，促使生命科学迈向“造物致知、造物致用”的新格局。基于此，合成生物学成为微生物设计与改造的有效工具，保障高附加值代谢物高效合成。例如，Liu等团队深度挖掘Erigeron breviscapus基因组序列，并借助合成生物学工具，实现在酵母生产breviscapine。其中，合成生物学的自动化技术以“设计-构建-测试-学习”的闭环思维，实现从上游基因元件设计、组装与下游产物测试、再设计等各个环节一体化，有效增强合成生物学理性改造微生物代谢流的深度与广度，实现高附加值代谢物高效合成。因此，借助自动化技术连续进化各类高附加值化合物代谢通路关键性酶，可有效维持细胞正常的生理环境，平衡细胞生长与核心代谢物合成代谢的资源分配，减少代谢溢流，并理性强化目标代谢物通路，创制微生物智能细胞工厂，实现高附加值化合物高效合成。

微生物合成法可有效克服植物来源天然产物供应不足的技术瓶颈。值得注意的是，微生物内源代谢网络复杂，且代谢物合成的细胞生理环境实时变化，因此，需借助系统生物学技术平衡细胞内源与外源代谢流的资源分配，但是系统生物学技术仅从全局水平提供可调控的关键性节点，后期仍需基因操作技术予以验证。

针对该瓶颈，近期崛起的系统基因组网络操作技术与合成生物学技术加速了微生物高附加值智能细胞工厂的进程。其中，合成生物学的自动化技术以“设计-构建-测试-学习”的闭环式理念，革新了微生物代谢工程改造的进程。此外，理性进化核心代谢流关键性酶，保障微生物打赢“内源生长代谢与目标代谢的实时博弈战事”，智能分配生长代谢与目标代谢流资源，保障高效合成目标代谢物。目前，大部分关键性酶缺乏晶体结构，随机突变成为酶定向改造的常用方法。突变库库容量宏大，且无高效、稳定的分子探针系统或化学方法，上述困境严重阻碍了最优突变体筛选，因此，高效的筛选方法成为核心代谢改造的瓶颈性问题。