[发明专利]同时检测对虾WSSV、IHHNV、EHP、SHIV多重荧光PCR检测试剂盒及方法

说明书

本发明公开同时检测对虾WSSV、IHHNV、EHP、SHIV多重荧光PCR检测试剂盒，包括冻干固态PCR Mix，液态复溶Buffer、冻干固态阴性对照和冻干固态阳性对照，所述冻干固态PCR Mix含有WSSV VP644基因、IHHNV NS2基因、EHP 18s基因和SHIV MCP基因对应的特异性引物探针序列组；所述引物和探针的序列如SEQ ID NO:1‑12所示。本发明还提供使用上述试剂盒检测对虾WSSV、IHHNV、EHP、SHIV的方法。本发明提供的试剂盒采用全预混冻干多重荧光PCR法，能够同时检测对虾WSSV、IHHNV、EHP、SHIV这四种病原体，大大节约的检测时间，具有灵敏度高、操作技术要求低和防污染等优点。

技术领域

本发明涉及体外诊断、病原检测技术领域，更具体地说，涉及同时检测对虾WSSV、IHHNV、EHP、SHIV多重荧光PCR检测试剂盒及方法。

背景技术

随着我国水产养殖业的迅速发展，高密度集约化养殖模式导致了养殖水环境逐渐恶化导致虾病的广泛流行，由于虾病发病迅速、传播速度快，可导致对虾生长极其缓慢、停滞、死亡等原因，2018年水产养殖圆桌会议上有报告指出，虾病每年至少造成200亿美元的损失。白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus，IHHNV)虾病具有世界爆发流行性，近几年虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)和虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV)虾病在我国也开始流行，虾病防疫尤其重要。多种虾病目前仍无有效治疗药物和疫苗接种方法，因此在虾苗检疫、亲虾筛选及成虾养殖过程中及时准确对虾病进行检测，对虾养殖模式制定相应措施，对有效防控虾病具有重要意义。

目前虾病的检测方法主要包括组织病理学和分子生物学。光学显微镜诊断：光学显微镜诊断法具有方便、快速、简单等优点，但是对工作人员的实践经验要求较高；胶体金免疫层析技术检测法：检测快捷、成本低、操作简单等优点而被广泛应用于病原检测，但存在灵敏度低及一次仅能检测单一病原的缺点；巢式PCR技术：巢式PCR的优点在于不仅能提高PCR的灵敏度缺点容易产生气溶胶使检测结果出现检阳性；LAMP技术：检测时间短，但是容易产生假阳性；基因芯片技术：该技术在实际应用过程中存在检测结果不稳定、仪器设备和芯片制备费高等问题；荧光定量PCR技术：RT-qPCR具有定量准确、特异性强、灵敏度高、快速、操作简便等优势而广受人们青睐，在病原检测中应用广泛。这些检测方法在灵敏度和便捷程度上各有优缺点，因此建立一种监测成本低、操作简单、检测灵敏度高的虾病检测方法，有利于对病原的早期诊断，便于及时采取有效的防治措施。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于解决的现有虾病的检测方法、检测成本高、操作复杂、检测灵敏度低的问题。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

同时检测对虾WSSV、IHHNV、EHP、SHIV多重荧光PCR检测试剂盒，包括冻干固态PCRMix，液态复溶Buffer、冻干固态阴性对照和冻干固态阳性对照，所述冻干固态PCR Mix含有WSSV VP644基因、IHHNV NS2基因、EHP 18s基因和SHIV MCP基因对应的特异性引物探针序列组；

所述冻干固态PCR Mix含有WSSV上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；IHHNV上游引物序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物序列如SEQ ID NO:5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示；EHP上游引物序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物序列如SEQ ID NO:8所示，探针序列如SEQ ID NO:9所示；SHIV上游引物序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物序列如SEQ ID NO:11所示，探针序列如SEQID NO:12所示；